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真核细胞结构与功能研究进展论文

发布时间:2024-07-03 14:53:02

真核细胞结构与功能研究进展论文

细胞膜 保护细胞,化学反应的场所,信息交换媒介 细胞质 细胞器存在的场所,化学反应的场所 细胞核 储存遗传物质的场所 线粒体 细胞能量的工厂 高尔基体 分泌 内质网 中心体附着的部位,也有分泌功能 中心体 叶绿体 高等绿色植物有,光合作用的场所

植物细胞器间遗传信息转移董色白艳玲*徐海津张秀明乔明强(南开大学生命科学学院,天津300071)摘要真核生物细胞质中有多种执行特定功能的细胞器,其中线粒体和质体含有独立的基因组,但细胞器的遗传信息储量有限,其多数结构和功能蛋白质仍然由核基因组编码。来自植物的相关研究表明,细胞核与细胞器间不仅在功能上相互依存,而且遗传信息分子能跨越生物膜屏障,在细胞核与细胞器间及不同的细胞器间进行传递,并由此可以引起部分遗传信息在细胞内定位及基因表达等方面的相应改变。细胞器间遗传信息转移机制的研究将为深入认识核质相互作用及真核生物的进化提供重要的线索。关键词细胞器;遗传信息;传递真核生物细胞内具有两种遗传系统:独立自主的细胞核基因组和具有半自主性的核外基因组。核外基因组主要是动植物共有的线粒体和植物所特有的质体。绝大多数遗传信息位于细胞核,而线粒体和质体仅包含为数有限的与细胞器功能相关的基因。在起源上,对于线粒体和质体有两种推测:(1)细胞器是由细胞核分离出的部分基因组成[1]。(2)细胞器来源于内共生的自养微生物[2]。现在人们普遍接受内共生学说,该学说认为线粒体起源于变形菌(Proteobacterium),质体起源于蓝细菌(Cyanobacterium)[3]。内共生体进化的典型特征就是基因逐渐趋于简化,简化过程即基因丢失或转移的过程。转移是指在进化过程当中细胞器的部分基因转移到细胞核,随着这一过程的进行遗传信息逐渐集中于细胞核。转移到细胞核的基因一方面扩大了细胞核的基因含量,另一方面也使得一部分核基因的功能取代了线粒体和质体基因的功能。然而,遗传信息的交流并不是单方向的,也有细胞核基因转移到细胞器,同时线粒体和质体之间也存在着基因的交流。只是质体基因组相对保守,不同的植物间质体基因组相差无几,而线粒体则相反,在不同植物间线粒体基因组大小差距很大。植物细胞内一直都进行着细胞核、线粒体和质体基因组间的遗传信息传递,只是传递方式各有不同。对细胞内遗传信息的交流及其传递方式的研究逐步揭开了细胞器进化的面纱,为实现细胞器遗传转化提供了重要依据。1细胞器间遗传信息的传递谢谢采纳

微管功能与细胞结构论文参考文献

微管是构成细胞骨架的重要组成部分,功能主要是维持和支撑细胞的形态,同是也是细胞与细胞,细胞器与细胞器之间信息交流的通道。

微管和微丝好像都是构成细胞骨架的

微管具有聚合和解聚的动力学特性,在维持细胞形态、细胞分裂、信号转导及物质输送等过程中起着重要作用。生理情况下,细胞的结构、细胞器的定位和功能取决于微管结构的稳定程度。

1、微管组成了鞭毛和纤毛,促成了它们的运动。构成鞭毛和纤毛的微管结构是“9+2”型,即外周由9对二联管(每对含有一个A亚丝,一个B亚丝)组成,中间有一对微管。

2、微管参与神经细胞内递质的传递,参与细胞内小泡以及色素的运输,对细胞器如线粒体、核糖体定位有一定的支持作用。

3、微管组成纺锤体,在细胞分裂时染色体的运动上起重要作用。

4、在早期胚胎的形态发生过程中,微管起决定作用。

5、微管与其他纤维一起构成细胞骨架,微管双螺旋结构支撑着细胞生理形态,其自身不会发生收缩,因而可以维持细胞的生理形态。

扩展资料:

微管连接纠错机制研究

细胞通过有丝分裂将姐妹染色单体均等分配到两个子细胞,是细胞遗传信息准确传递的关键机制,对于维持基因组稳定性具有重要意义。有丝分裂异常将导致多倍体细胞的产生,进而引发肿瘤等多种疾病,而动粒与微管的正确连接是细胞有丝分裂正常进行的保证。

当前研究已发现有多个外层动粒蛋白能被Aurora B磷酸化以激活纺锤体检验点纠正动粒—微管的错误连接,使染色体正确分离。但是否存在内层动粒蛋白能被Aurora B磷酸化,在动粒—微管连接纠错过程中发挥作用尚不清晰。

参考资料来源:百度百科-微管

构成细胞骨架细胞分裂时纺锤丝的成分鞭毛的成分纤毛的成分……

胚胎细胞核移植最新研究进展论文

克隆”是从英文“clone”音译而来,在生物学领域有3个不同层次的含义。 1.在分子水平,克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中,然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2.在细胞水平,克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如,使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如,在脊椎动物体内,当有外源物(如细菌或病毒)侵入时,会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成,这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式-无性繁殖,即不经过两性结合,子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低,越有可能采取这种繁殖方式。 3.在个体水平,克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如,两个同卵双胞胎即为一个克隆!因为他(她)们来自同一个卵细胞,所以遗传背景完全一样。按此定义,“多利”并不能说成是一个克隆!因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中,得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中,作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外,克隆也可以做动词用,意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1.DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样,其基本过程如下图所示(未按比例) 可见,这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面,包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理,以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2.生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代,植物学家用胡萝卜为模型材料,研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题,他们惊奇地发现,从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此,他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样,故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布,世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生,这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊,两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息,即提供了细胞核(称之为供体);一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞;另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫,是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下: 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞,将其放入低浓度的营养培养液中,细胞逐渐停止了分裂,此细胞称之为供体细胞;给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素,促使它排卵,取出未受精的卵细胞,并立即将其细胞核除去,留下一个无核的卵细胞,此细胞称之为受体细胞;利用电脉冲的方法,使供体细胞和受体细胞发生融合,最后形成了融合细胞,由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应,使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化,从而形成胚胎细胞;将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内,胚胎细胞进一步分化和发育,最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后,另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只,还不够叫做克隆羊的话,这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中,卵丘细胞是经如下过程得到的:通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素,使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10-12微米的卵丘细胞用作细胞核供体(前期实验表明,若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核,经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期)。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中,在3小时内进行细胞核移植(与此不同的是,在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3-6次) 卵母细胞(一般处于减数分裂中期 II )通过与上面描述类似的方法,从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核,尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核,也尽量去除所带的细胞质(通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次,以去除所带的少量的细胞质)。在细胞核被取出后5分钟之内,直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1-6小时,然后加入二价的锶离子(Sr2+)和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活,后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞,放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎(从2细胞期到胚泡期)被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国,除猴子以外,其他克隆动物都有,也能连续核移植克隆山羊,该技术比胚胎分割技术更进一步,将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多,每份细胞越少,发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个,就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1. 克隆技术与遗传育种 在农业方面,人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种,大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2. 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音,具有很大的应用前景。从生物学的角度看,这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3. 克隆技术与医学 在当代,医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言,器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”,作器官移植之用,则绝对没有排斥反应之虑,因为二者基因相配,组织也相配。问题是,利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道?是否合法?经济是否合算? 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因,例如,在医学方面,人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素,等等。

我给你找了几篇,累死我了。呵呵。标题都可是《有感于克隆》 1 近年来,“克隆”二字在媒体刊物中频繁出现,吸引着人们好奇的眼球。“克隆人”技术的可行性和合法性在科学和道德等方面引起了人类广泛的争议。 “克隆”一词是一个泊来品,是英文clone的音译。简单地讲“克隆”就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与一般的无性繁殖是有区别的,科学家把人工遗传操作动物的繁殖过程叫克隆,这门生物技术叫克隆技术。克隆技术可以精细到以单个基因复制为单位,科学家将某种特定基因单离出来,将它与某有机体如某种酵母相结合,有机体将新基因融入自己的DNA结构后再行繁殖,产生出理想基因的复制品。 “拷贝”也是一个泊来词,它来自于电子文档的“copy”。在某种意义上来讲,“克隆”和“拷贝”具有一定程度的相似性。 有时候哀叹中华文化的“纯正性”遭到泊来品的侵袭,使得诸如这些clone、copy、DNA之类充斥于方块汉字之间。有时却也为人类文化遗产的大融合而感到欣慰。 前些天临写虞世南《孔子庙堂碑》,写到“圣期大唐,运膺九五,……于是在三睠命,吹万归仁,克隆帝道,丕承鸿业”,突觉眼睛一亮,这“帝道”还有可以“克隆”的?难道古人早已知道千年后的今天要产生一种“克隆”技术,或者说现代科学的术语与古人思想暗合?如果“帝道”可以“克隆”的话,我们只要照样“拷贝”三皇五帝、鸟生渔汤(尧舜禹汤),甚至“贞观”“开元”,岂不是好! 《孔子庙堂碑》为虞世南撰文并书写,碑文记载唐高祖五年,封孔子二十三世后裔孔德伦为褒圣侯,及修缮孔庙之事。虞书对于后世书风影响极大,黄山谷曾有“虞书庙堂贞观刻,千两黄金哪购得”之说。以前临写碑帖,重点放在其书法结体方面,对碑帖的内容只求有一定程度的了解,而不做太多的深究。怀着某种奇妙的心情,这一次认真仔细地研读了《庙堂碑》的碑文内容,对其中漫患缺失之字也进行了相当的考究,有些地方还专门请教了有关的专家学者。 世界上怕就怕认真二字。深究之下,原来此“克隆”非彼“克隆”。在“克隆帝道,丕承鸿业”中,“克”作“能够”解,如“克尽职守”、“克承”等均含此意。而“隆”可解释为“尊崇”或“使兴盛”,前者如“学之经,莫速乎好其人,隆礼次之”(《荀子》),后者如“隆国保家”等。于是乎“克隆帝道”可以解释为“能够尊崇帝王之道”“能够弘扬帝王之道”。 “克隆帝道”与“clone帝道”虽然其意不同,后者却也能自圆其说。如果能够使帝王之道“批量繁殖”,使人人皆成孔孟,岂不天下大同,从而实现圣人之治? 一时有感,是故乱侃。 2 随着“克隆”时代的来临,想必我们对“克隆”本身并不陌生,但随着“克隆”一词的广泛延伸到生活中,生活中无处不充满“克隆”的气息,而文学作品也成为“克隆”的理想温床。 而我却甘愿“克隆”,因为我们都知道,任何一个文学大师,他都是从“克隆”别人的东西,来寻找自己的理想之路,从别人的写作方式吸收营养变成自己的东西,当他到一个阶段后“克隆”这时就变成了自己的东西,那时他就不需要再“克隆”,有了自己的精神世界,别人的精神世界就无法容纳自己的思想了。 而有一种现象非常有趣,当我“克隆”别人的作品时,我发现也有人“克隆”我的东西,有句话说得好,好文传天下,真正传的是一种情绪,而正是这种情绪使人们明白生活不是梦境,但求个心灵自由。这时我会非常的高兴,高兴大家一起玩同一个文字游戏。如今是一个善于炒作的年代,往往一篇文章会出现不同的版本,后来才发现大家不过玩得是一个命题作文,遍地开花而已。这种跟风的思想是每个人都常有的,所以最时髦就是吃别人剩饭,比如写一篇以流行歌曲命名的文章,这样往往会起到非常好的共鸣效果。其实这也是一种“克隆”,他是“克隆”本身的延伸、扩大和其他。而我们往往沉迷其中,因为爱所以爱,哪怕是虚伪也乐此不疲。 当一个人名气大过一个人的时候,别人只当你是换了一个马甲,那时那些克隆别人东西的人才发现,他只不过成了原作者的阶石,成全了别人的更大名气和利益,比如网络上的一些查询功能就可以方便一些人进行更大力度的宣传,一些并不熟悉的网站,通过你的克隆会使原作者发现新大陆,使他更为兴奋,能更好地向全世界宣传,让世界都知道他,让他与世界沟通,这时“克隆”就是一种享受,何乐而不为。 现代社会是一个知识抢夺的时代,你想得到的,别人同样想得到。这时克隆好像长得像的人,只不过做着异曲同工的事罢了。如今的一些名家大师们当然很少上网,但是他们特别注重知识产权的保护和个人利益,作为没有什么名气的我,我甘愿“克隆”,我知道我甘愿的目的不在不保护自己的知识产权,也不在于随便侵犯别人的知识产权,目的是改变自己的思想世界,使自己能够有自己的独特掌握思想世界的能力,这时“克隆”的双赢效果就达到了。当然,那些不善于“克隆”的人往往会引发官司那你们就得不偿失了。我总结了我的“克隆”经验:首先,要有自己独特观点,“克隆”别人的东西首先要精华原作,再加上自己思想内容,特别是题目要取得引人入胜,心理学上叫混淆视听,让人们感觉你才是原作者;其次,要在文头和结尾段落尽量不要和原文一样,文字游戏玩一玩也不是很难的,我就不多说了,我想大家都明白;最后,一篇“克隆”文章成不成功,最重要的就是丰富其框架,你可以打破原有所有文章的框架,重新组合,使文章焕然一新,成为你自己的东西。 甘愿“克隆”的时代,是人们与日益增长文化需要的一种代替品,他的出现将会很长一段时间存在,但从“克隆”变成真正的自己,那就看自己能不能找到自己的路,有时一个人一生也找不到,有时一个人会在很短时间找到,许多文学大师就是找得快速的人。 所有的悲欢离合都是梦,“克隆”痛并快乐着,克不克隆就让时间证明一切,时间取决了一个真实的你,一个真正的世界,一篇真实的文章。而人们却永远忘记了作者,所以人们看懂的只是情绪,作者不过是历史长河中的一颗沙,好渺小。谁也不知道那些古人的作品是不是就是自己原创,而古代一个个写作家的写作,为了只是心情愉悦,并没有想美名传千载,我们这些后人只是受益者,因为那些思想的撞击,使我们更了解古代人的生活等各方面的事情,具有研究价值,除此之外,我想一个对文学不感兴趣的人,文学就是很肉麻而且无用的东西,但我们都知道,一个真正读懂的人,他所体会到得东西只是一种情绪,也只能是一种情绪。因为人是多愁善感的,才丰富了如今的文化市场,有看者才有写者,所以才有“克隆”。更映证了一句话:“天下文章一大抄,那管谁是真英雄。”参考资料:我在红袖的文集,欢迎光临:

克隆一词是由clone音译而来,在音译名出现以前曾有一个意译名--无性繁殖系,指由单一细胞或共同祖先经有丝分裂得到的细胞群体或有机群体。我们通过细胞培养可以得到一个细胞克隆。克隆技术简史(小资料) 1938年,第一位现代胚胎学家、德国的汉斯•斯皮曼博士建议用成熟的细胞核植入卵子的办法进行哺乳动物克隆。 1952年,运用斯皮曼的构想,出现世界上第一只克隆青蛙。 1962年,约翰•格登宣布他用一个成熟细胞克隆出一只蝌蚪,从而引发了关于克隆的第一轮辩论。 1984年,斯蒂恩•威拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊。这是第一例得到证实的克隆哺乳动物。 1995年10月,美国麻省麻醉学家维坎蒂博士利用改良组织工程,令老鼠背上长出人耳,从而使人类能在实验室培育出可向人类移植的皮肤和软骨。 1996年7月,英国苏格兰罗斯林研究所成功地用羊乳腺细胞克隆出小绵羊"多利"。 1997年10月,英国专家研制出一个无头的青蛙胚胎,令其有关技术可以制造人类器官以便作为医学移植用途。 1999年7月,日本科学家克隆出多头牛,并将其肉类推向市场出售。 2000年4月,美国先进细胞工程公司克隆出6头比它们本身实际年龄年轻的小牛。 2000年,美国科学家用无性繁殖技术成功克隆出一只猴子"泰特拉",这意味着克隆人本身已没有技术障碍。 2001年11月25日,美国马萨诸塞州的生物技术公司成功克隆出人类胚胎,在克隆技术上迈出了重要一步。不过该公司表示其目的不是为了克隆人,而是为了获得能够用于治疗帕金森综合征和青少年糖尿病等各种疾病的干细胞。克隆是什么?克隆一词是由clone音译而来,在音译名出现以前曾有一个意译名--无性繁殖系,指由单一细胞或共同祖先经有丝分裂得到的细胞群体或有机群体。我们通过细胞培养可以得到一个细胞克隆。在微生物实验时,通过倒平皿,我们可以得到一个个的菌落,这些菌落其实就是细菌的克隆。可见克隆原来是个名词,指一群细胞或一群个体。随着分子生物学的发展,出现了核移植与基因工程之类的操作。核移植操作可以得到重建细胞,重建细胞可以繁殖成一个无性系;基因工程操作可以将某一被选定的基因拼接到质粒的复制子上,随着复制子的复制也能得到DNA分子的无性系。于是,有人就把这类操作称作克隆,即将clone一词由名词转化成动词,并将核移植称为 nuclear cloning(核克隆),通过基因工程得到DNA分子的无性系称为molecular cloning(分子克隆)。在这里克隆是一种实现无性繁殖(asexual reproduction)的操作,是一种显微操作或分子生物学操作,而不是一般意义上的无性繁殖(或无性繁殖操作)。这也许正是克隆一词能够存在而不被无性繁殖替代的原因。 克隆羊 多利羊又称克隆羊,其实是用核克隆技术产生的羊。有人说,只有多利羊才是真正的克隆羊,其他报导,如克隆猪、克隆牛等,由于它们是由胚胎细胞发育而成的,而胚胎细胞是有性繁殖产生的,所以,不是真正意义上的克隆。这是一种误解,是由于对有性过程在时间上把握不准所造成的。有性过程到受精卵、即合子形成时即告结束,合子分裂一旦开始即与有性过程无关了。如果说分裂后的胚胎细胞是有性繁殖产生的,那么,体细胞追究下去也是有性繁殖产生的。但事实上它们都是由合子经有丝分裂逐渐产生的。这就是说,有性繁殖实际上是经过一次有性过程和许多次无性过程,最后产生一个成活的后代而实现的。从胚胎中取出一个细胞使之发育成一个个体,这显然应属于无性繁殖。所以,从这个意义上讲,杜里舒是克隆技术(细胞克隆技术)的创始人,他的将两分裂球时期的细胞分开,使之发育成两个海胆的实验,是最早的克隆实验。而人类的同卵双生双胞胎,就是经天然细胞克隆化产生的。而克隆猪、克隆牛,如果是经核移植育成的,则不管供核细胞是来自早期胚胎细胞,还是已分化细胞,均属于真正意义上的克隆技术,而且是比杜里舒的水平高得多的克隆技术。走近"基因药物人们为了实现某种目的,将克隆的外源目的基因(一般是人的DNA ),整合到动物受精卵的染色体内,使之在动物体内得到表达并能稳定地遗传给后代,这种含有外源基因的动物就叫做转基因动物。从事这项研究的科学家们说,一头转基因动物就是一座天然基因药物制造厂,不仅可以大大降低成本,而且还能够扩大生产,获得更多的基因药物。 利用转基因动物来生产基因药物是一种全新的生产模式,与传统的制药技术相比具有无可比拟的优越性。以美国为例,凝血因子Ⅷ的年需要量约为120 克。过去,这120克凝血因子Ⅷ需要120万升血浆提取,以每人献血200 毫升计,需600 名献血员提供血浆才能满足。而用转基因牛来生产,一头牛每年的奶产量是1万公斤,如每公斤乳汁中可制造10毫克凝血因子Ⅷ的话,那就只需头这种牛即可满足需要。再以白蛋白为例,美国的年需要量为10万克,过去需从200 万升血浆中提取,而用转基因牛来生产,以每公斤乳汁制造2 克的蛋白计算,就只需5000头牛即可解决。此外,从人血中提取血清蛋白质可能产生的肝炎、艾滋病等传染性疾病,也可因此而得以避免。 生物技术是当今最为活跃的一门技术。1971年,诺贝尔奖获得者保罗•伯格首次成功地把两种不同的基因拼接在一起,使生物技术发展到基因重组与移植的新阶段。此后,基因重组技术取得了一个个丰硕成果。1978年合成了人工胰岛素,1979年实现了生长激素基因在大肠杆菌中的表达,1982年研制成功了人工干扰素,基因制药从此走上了产业化道路。但是,目前的基因药物是通过基因重组技术培育大肠杆菌和动物细胞来制造的,而大肠杆菌这类低等生物是不可能生产出结构复杂的药物,动物细胞培养的成本又太高。所以,利用基因重组与移植技术来培育转基因动物生产药物便应运而生了在利用转基因动物提取药物方面,英国科学家首开先河。1997年年底,英国PPL治疗学公司率先利用克隆"多利"所采用的"细胞核转变"法,培育出200头携带人体基因的绵羊,并成功地从奶汁中提取了α-1抗胰蛋白酶。这是科学家首次从遗传工程培育的绵羊的奶中,提取可用于治疗人类疾病的药物成分,为建立"动物药厂" 打下了基础。随后,芬兰科学家将人体的促红细胞生长素基因,植入乳牛的受精卵中,创造了一种能生产出促红细胞生长素的乳牛。从理论上说,这种乳牛一年可提取60-80千克促红生长素,比目前全世界的使用量还多。假如你是足球迷,你肯定希望世上再多一个罗纳尔多;假如你是音乐爱好者,你当然愿意再拥有一个贝多芬;再有一个爱迪生、爱因斯坦也是许多人所梦想的。古希腊有位哲学家曾经说过"世上不可能有两片完全相同的叶子",换句话,以上的梦想都只能是空想,没有实现的可能。但是,现在情况却有了变化,有一种新兴生物技术"克隆",或许可以做到这一点。那么克隆是什么呢?它奇妙在哪里呢?今天,就让我们一起走近——"奇妙的克隆"。 我们身边哪些动、植物先天具有克隆的本领?具有克隆能力的动植物有:土豆、蚯蚓、桑树,丝瓜藤,吊兰.水母,海参、仙人掌。水母在遭到伤害后,伤口会自动补好。章鱼的触手可以再生。龙虾的大钳子掉了 ,还会再长出来。还有秋海棠、富贵竹,它们插枝即活。壁虎。它遇到危险时,就将自己的尾巴断掉,然后再长出来。能不能找出这些天生具有克隆本领的动植物的共同点,用自己的话说说克隆是什么?不由生殖细胞结合产生的后代。克隆技术可以造福于人类:能使不具备繁殖能力的动物诸如骡扩大繁殖,还能挽救濒危动物。假如你也掌握了克隆技术,你想克隆什么呢?为什么要克隆它?要求:1、想法要奇妙;2、想法要有益于人类;3、表达要有条理,语气、语调适当。如果让我克隆,我会克隆无数对明澈的眼睛。许多人认为有一双好眼睛是理所当然的事,而我并不这么认为。当你看到那毫无光芒的双眼,听到期盼光明的心灵的呼唤,难道你的心灵没有震动吗?上天对他们不公,就让科学来为他们创造光明,就让社会让他们体会真爱。我坚信"科技以人为本"并不是空话。所以我要克隆眼睛,让更多的人重见光明.我想克隆恐龙。因为我喜欢恐龙,想再现恐龙时代的盛景。而且具备克隆恐龙的条件,因为恐龙时代的南极有可能处在温带地区,当恐龙死后尸体藏在南极中,而此时的南极很可能已在冰天雪地中,由于寒冷可防止身体的腐化,所以可以提取恐龙的DNA,从而克隆恐龙,这样也可以使后代开阔眼界。我不主张象他那样去克隆一些史前生物,如恐龙、猛蚂等。因为任何生物的生存与灭绝都不是人类所能控制的,人类应该严格遵守"自然法则",让生物的发展顺其自然。如果再回到从前,就可能破坏生态平衡。我想克隆水,目前世界上的淡水资源严重缺乏,已无法维持人类生存,而人类仍在无限制地浪费水,所以我想克隆水。我要克隆粮食,拯救非洲正在挨苦受饿的人们,使他们过上温饱的日子。我们都知道,热带雨林是地球之肺。而亚马逊平原是世界上最大的热带雨林,占地球上热带雨林总面积的50%,达650万平方公里。这里自然资源丰富,物种繁多,被称为"生物学家的天堂"。然而,亚马逊却没有因为它的富有得到人们的厚爱。70年代以来,人们的滥砍滥伐使其三分之一的面容消失在我们眼前,这将意味着维持人类生存的氧气将减少五分之一。所以,我想克隆亚马逊热带雨林,将其安放在撒哈拉沙漠上,使之净化环境。我反对刚才三位同学的说法。他们的想法很好,表达了他们忧国忧民之心,表达了他们的美好愿望。可是水、热带雨林、粮食没有细胞,如何克隆?(众笑)(有人小声插话):水可以的,有水分子。如果我有克隆的技术,我会克隆孙悟空,因为他无所不能,可以实现我们很多改变社会的理想。(众大笑)师:感谢这些同学给大家带来的大胆的、新奇的"克隆理想",不管它们符不符和科学原理,但都表现了大家的美好愿望,希望科技能来社会的进步,使人类的生活更幸福!围绕"克隆技术造福人类?!"的辩题展开讨论。)师:辩论要求:(1)语言清晰、流畅,声音洪亮;(2)观点鲜明,论据充足;(3)驳斥对方观点时既要有"理",又要有"礼"。(以"克隆技术能造福人类"为正方,"克隆技术不能造福人类"为反方展开辩论)正方:我认为"克隆技术能造福人类",课文的第四章节不是非常详细地介绍了克隆对人类的作用吗?如能使不具备繁殖能力的动物扩大繁殖,据有关报道,公驴和母马所生出来的杂种动物——骡,如何繁殖这些优良品种呢?只能用克隆。还能挽救如熊猫这类繁殖能力低的濒危动物。反方:我觉得克隆无益于人类。你别不相信,请听我慢慢道来。(停顿,由于太激动,又重复了一遍,众笑)首先克隆正如正方辩友所说,的确可以挽救濒危动物,但你可曾想到,这样的克隆会破坏动物种群的正常发展,使动物走向衰弱,就算可以救一时,难道可以救一世吗?我想不可能。有人说克隆可以使动植物再生,有没有想过,只要人类不刻意破坏,这样的生态平衡已维持了千万年,你这样无限制的克隆,是否破坏了它的食物链,又是另一种生态平衡的破坏呢?正方:我听说在亚马逊的热带雨林中每天都要消失近百种植物,所以克隆能挽救一部分植物,虽然不是全部,但仍能部分保存。现在的克隆技术虽然不是十分发达,但我相信今后克隆水平会更好,这时克隆就有它的用武之地了,总不能等到地球全部荒芜才研究克隆吧?反方(冷笑):对方辩友真是对未来充满希望啊!可是这也证明了这只是你的美好想象,寄希望于克隆技术的提高,而事实上呢,经过了247次失败后,才得到了"多利"克隆小绵羊。在这个过程中需要伤害多少动物啊,这与我们克隆的初衷不是背道而驰吗?正方:失败乃成功之母嘛!(众笑)现在的克隆技术或许不发达,但在今后我相信人类的克隆水平会越来越好,克隆出来的动植物会越来越优异,象失败247次这样的事将不再发生,它最终会造福于人类。而且克隆对于研究有些疾病和研究人的寿命有不可低估的作用。当某一天我们自身的某个器官出了问题,就可以从先前克隆的胚胎中取出这个器官进行培养,然后替换自己病变的器官。我们就再也不必害怕疾病了。所以克隆对人类还是有益的。反方:你还嫌世界上的人口不多吗?如果一有严重的疾病就换器官,人不是都可以长生不老?如果这样,地球人口增长率岂不达到极点,地球不就要出现危机了吗?正方:或许那时人们可以到其他星球中生活了!(众笑)反方:我想说说克隆人有哪些危害。(反方同学鼓掌)比如,如果克隆的供体细胞发生变异,或者培养胚胎的培养基因与科学家开了小小的玩笑,克隆出一个废品,我们能象对待阿狗阿猫那样处置他们吗?器官移植,供体匮乏,能不能未雨绸缪,为自己克隆一个器官仓库,以供将来不测之需?如果能,人们能够坦然从与我们一样五官齐全,表情丰富的克隆人身上摘下一只肾,挖走有一只眼吗?人类早就期望借助机器人,从繁重或危险的劳动中解脱,但再灵巧的机器人也是笨拙难如人意。能不能克隆一个"我"的替代品,赋予他灵巧的四肢和绝对服从的意志?如果那样,是不是有一天觉醒的克隆人会向我们呐喊:"王侯将相,宁有种乎?"(反方同学热烈鼓掌,并大声叫好) 依样画葫芦克隆出的一个新生命,他们是儿子,还是弟弟?是女儿?还是妹妹?如果面对一群面貌、体态、风姿一样的克隆人,我们如何确认他们的身份?如果他们犯罪,我们又有什么手段缉拿真凶?再说,人类居住的地球早已因为人口爆炸难堪重荷,我们还有什么理由用另一种方法生产自身?(再次响起掌声)正方(激动地):事物总有它的两面性,你不能十分果断地判断它是好是坏。我认为一个技术存在就一定有它存在的理由。你不能否认它有对人类造福的一面,不能将它一棍子打死。克隆技术能否为人类造福是要看它克隆的对象是什么,在什么领域,它固然有坏处,是因为任何事都有它的双面性,不能是纯粹的好与坏,所以不能说克隆技术是绝无益处的。师(做暂停的动作,学生依然激动万分):同学们各抒己见,对此提出了不少看法,或许不够深刻,却是朴素而真实的。坦白地说,我在这方面的知识未必比你们高深,你们的发言给了我启发。克隆技术取得突破性进展,世界为之轰动,它对我们人类究竟是利大于弊,还是弊大于利呢?现在下结论还为时过早,这篇课文里引用了诺贝尔奖获得者、著名分子生物学家J.D.沃森的话作结束语: "许多生物学家,特别是那些从事无性繁殖研究的科学家,将会严肃地考虑它的含义,并展开科学讨论,用以教育世界人民。",这也正是我们所期待的,我们希望"克隆技术造福人类"。

克隆实际上是无性繁殖,如细菌,土豆、草莓等都可以通过无性繁殖的方法繁殖后代,农业中常用到的扦插、嫁接也属于无性繁殖,这说明无性繁殖的方法在自然界中是存在的,很多生物都利用这种方法繁殖后代;我们现在所谓的克隆多指动物的无性繁殖,而我认为这些克隆试验知识证明了动物进行无性繁殖的可能,而并不能认为是违背自然规律的。 2.克隆人的必要性。随着科学技术的发展,克隆技术终会变得很成熟,克隆人也是完全可能的。然而克隆人的讨论远不仅仅是技术问题,同样还有道德问题。克隆人该不该算是真正意义上的人类,如果是,有些国家在胚胎发育到14周的时候就拥有了生存权,就不能像我们实验室里的小动物一样要杀要剐随便了,那后面的研究怎么办呢?克隆可以复制基因,但不可以复制思想,即使是两个长相相同的人也许会有完全相反的性格,因为后来的生活环境和教育方法、程度 都会成为影响因素;如果其中一个犯罪,而两个人又具有相同的DNA,我们该如何区分? 克隆是英文clone的音译,简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式,常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆,这门生物技术叫克隆技术。 克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中,利用微电流刺激等使两者融合为一体,然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎,当胚胎发育到一定程度后,再被植入动物子宫中使动物怀孕,便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造,那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。 克隆技术不需要雌雄交配,不需要精子和卵子的结合,只需从动物身上提取一个单细胞,用人工的方法将其培养成胚胎,再将胚胎植入雌性动物体内,就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物,具有与单细胞供体完全相同的特征,是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功,被人们称为“历史性的事件,科学的创举”。有人甚至认为,克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”,可以用来“复制”人,因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说,克隆技术是悲是喜,是祸是福?唯物辩证法认为,世界上的任何事物都是矛盾的统一体,都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人,那会给人类社会带来什么呢?即使是用于“复制”普通的人,也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产,将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究,就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术,是一把双刃剑,剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动,避免“克隆人”的出现,使克隆技术造福于人类社会。 克隆技术研究现状 一、克隆的早期研究 克隆一词是英文单词clone的音译,作为名词,c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的,例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆,例如:同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而,天然的哺乳动物克隆的发生率极低,成员数目太少(一般为两个),且缺乏目的性,所以很少能够被用来为人类造福,因此,人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样,克隆一词就开始被用作动词,指人工培育克隆动物这一动作。 目前,生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”,以及其后各国科学家培育的各种克隆动物,采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植,是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核,经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中,重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同,细胞核移植技术,特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法,故人们往往把它称为动物克隆技术。 采用细胞核移植技术克隆动物的设想,最初由汉斯·施佩曼在1938年提出,他称之为“奇异的实验”,即从发育到后期的胚胎(成熟或未成熟的胚胎均可)中取出细胞核,将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起,科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验,先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年,我国童第周教授领导的科研组,首先以金鱼等为材料,研究了鱼类胚胎细胞核移植技术,获得成功。 哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年,施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊,其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年,维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年,尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年,在主要的哺乳动物中,胚胎细胞核移植都获得成功,包括冷冻和体外生产的胚胎;对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验,也都做了尝试。但到1995年为止,成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。 二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响 以上事实说明,在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前,胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上,“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程,但这并不能减低“多莉”的重大意义,因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物,是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着:在理论上证明了,同植物细胞一样,分化了的动物细胞核也具有全能性,在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化;在实践上证明了,利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的,将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植,并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作,从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。 在理论上,利用同样方法,人可以复制“克隆人”,这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此,“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响,并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应:克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此,克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐,从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。 三、近3年来克隆研究的重要成果 克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮,随后,有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月,即“多莉”诞生后1个月,美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过,他们都是采用胚胎细胞进行克隆,其意义不能与“多莉”相比。同年7月,罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”(Polly)。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月,美国夏威夷大学Wakayama等报道,由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠,其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代,这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外,Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术,这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。 此后,美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息;日本科学家的研究热情尤为惊人,1998年7月至1999年4月,东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方(石川县、大分县和鹿儿岛县等)家畜试验场以及民间企业(如日本最大的奶商品公司雪印乳业等)纷纷报道了,他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底,全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管/子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月,中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”,但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍,所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得,与克隆“多莉”的技术完全不同,这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。 在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果,1998年1月,美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体,成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎,这一研究结果表明,某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了,但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年,美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎;我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎,这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景,概括起来大致有以下四个方面:(1)培育优良畜种和生产实验动物;(2)生产转基因动物;(3)生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法;(4)复制濒危的动物物种,保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一,转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器,以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多,除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外,转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长,已进行了10多年,但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验,5~6个药品进入2期临床试验;而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵,以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状,是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命,动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移,可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时,采用转基因体细胞系,可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前,先把目的外源基因和标记基因(如LagZ基因和新霉素抗生基因)的融合基因导入培养的体细胞中,再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆,然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中,最后生产出的动物在理论上应是100%的阳性转基因动物。采用此法,Schnieke等(Bio Report,1997)已成功获得6只转基因绵羊,其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因(新霉素抗性基因),3只带有标记基因,目的外源基因整合率高达50%。Cibelli(Science,1997)同样利用核移植法获得3头转基因牛,证实了该法的有效性。由此可以看出,当今动物克隆技术最重要的应用方向之一,就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞(ES)是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型,来替代那些受损的体内组织,比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞,使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前,科学家已成功分离到人ES细胞(Thomson等1998,Science),而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚,把重组胚体外培养到囊胚,然后从囊胚内分离出ES细胞,获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞,肌肉细胞和血细胞),用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗,而非得到克隆个体,科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的,它为研究配子和胚胎发生,细胞和组织分化,基因表达调控,核质互作等机理提供了工具。 五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景,但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域,克隆技术在理论和技术上都还很不成熟,在理论上,分化的体细胞克隆对遗传物质重编(细胞核内所有或大部分基因关闭,细胞重新恢复全能性的过程)的机理还不清楚;克隆动物是否会记住供体细胞的年龄,克隆动物的连续后代是否会累积突变基因,以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中,克隆动物的成功率还很低,维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中,融合了277枚移植核的卵细胞,仅获得了“多莉”这一只成活羔羊,成功率只有%,同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有%和%,即使是使用“檀香山”技术,以分化程度较低的卵丘细胞为核供体,其成功率也只有百分之几。 此外,生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例,日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去;到2000年2月,日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生,但存活的只有64头。观察结果表明,部分犊牛胎盘功能不完善,其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平;有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育;克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向,这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”,也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒,它决定着细胞能够分裂的次数:每一次分裂端粒都会缩短,而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年,科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短,即其细胞处于更衰老的状态。当时认为,这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的,使其细胞具有成年细胞的印记,但这一解释目前受到了挑战,美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛,得到6头小牛,出生5~10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长,有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因,也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明,在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟,使其“恢复青春”,关于这种变化对克隆动物寿命的影响,还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外,克隆技术(尤其是在人胚胎方面的应用)对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明,世界各科技大国都不甘落后,谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性,在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月,英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告,表明英国政府将重新考虑这一决定,认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举,关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。

动物细胞工程的研究与进展论文

细胞工程论文

细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说,它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法,按照人们的设计蓝图,进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文,欢迎阅读。

【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架,并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架,冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后,用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全,其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性,并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示,羊膜上皮细胞在支架中分布均匀,生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架,其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。

【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性

近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限,去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2,3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4,5〕,促进神经元轴突的生长,是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架,并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内,探究两者的相容性,为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。

1 材料与方法

材料

实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司,SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。

方法

去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架,简述如下:取Wistar大鼠腹锯肌,放入蒸馏水中,在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中,摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液,摇床37℃,50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。

支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h,5%蔗糖90 min,15%蔗糖90 min,30%蔗糖过夜以梯度脱水,OCT包埋,冷丙酮速冻,之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片,HE 染色,观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。

人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素,200 μg/ml的谷氨酰胺),37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养,隔天换液,待单层培养细胞生长至80%汇合后,传代培养。

人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定

取生长良好的人羊膜上皮细胞,80%细胞接近融合,弃去培养液,胰蛋白酶消化,当胞体回缩,细胞间隙变宽时,用血清终止消化,反复轻吹瓶壁细胞,制成单细胞悬液于离心管中,1 000 r/min,离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液,以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中,在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养,隔天换液,培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L),继续培养1 d后,恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后,3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min,血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体,BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜,PBS 洗后,二抗37℃孵育30 min,PBS 洗后,SABC37℃孵育30 min,DAB显色。光镜下观察。

扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞,80%细胞接近融合时,用上述方法消化下来后,把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中,放在24孔板中,在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后,用2%戊二醛固定后,梯度乙醇脱水,CO2临界点干燥,镀膜,采用扫描电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看,肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整,支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分,胶原纤维为红色波浪状结构,弹性纤维为蓝色丝状结构,见图1。

羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2,HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好,分布均匀(图

图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色

图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示,BrdU阳性细胞数目多,提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示,支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒,呈棕褐色分布在细胞质中(图2C,2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示,在支架内部分布有大量细胞,细胞在支架中分布比较均匀,生长状态良好(图2E)。

3 讨 论

理想的支架材料应与细胞外基质类似,与活体细胞有良好的生物相容性〔7,8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势:(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用,研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕,它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕,该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉,静脉,神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果,发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的,而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9,12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白,并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布,其细胞外基质成分也是平行分布的,从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的,VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。

由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕,去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明,羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子,包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1,IL8 等因子,另外,还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞,与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀,抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力,并能表达BDNF和NT3,说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性,另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。

总之 ,本研究成功制备了去细胞肌肉支架,并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子,人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素,构成了良好的神经再生微环境,有利于使神经缺损得到较好地修复,为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。

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12 Brown AL,Farhat W,Merguerian PA,et week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23:217990.

13 李培建,李兵仓,胥少汀.肌基膜管移植修复脊髓缺损的实验研究〔J〕.中华创伤杂志,2001;17(9):5258.

动物细胞工程是基于现代细胞生物学与实验技术发展起来的一门新兴学科,是理论与实践紧密结合的学科,在高等院校生命学科的课程设置中占有重要地位。下面是我为大家整理的动物细胞工程论文,供大家参考。

摘 要 动物细胞工程是基于现代细胞生物学与实验技术发展起来的一门新兴学科,是理论与实践紧密结合的学科,在高等院校生命学科的课程设置中占有重要地位,本文就如何提高学生对本门课程的学习兴趣作一探讨,以为动物细胞工程这门课程的教学改革提供参考。

关键词 动物细胞工程 教学 兴趣教学

中图分类号:G424 文献标识码:A

Interesting Teaching of Animal Cell Engineering

XU Yipeng

(Zhejiang Biometric Quarantine and Inspection and Technology Laboratory,

College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou, Zhejiang 310018)

Abstract Based on the development of modern cell biology and technology of an emerging discipline, animal cell engineering is a course that closely integrate theory and practice and that plays an important role in the curriculum of life sciences in institutions of higher learning. This article discusses how to improve the students' interest in the animal cell engineering course, in order to provide a reference for the teaching reform of the animal cell engineering course.

Key words animal cell engineering; teaching; interesting teaching

细胞工程是指按照一定的设计方案,通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作,获得具有目的性状的细胞、组织、器官或者个体的综合性生物工程,是理论与实践相结合的典范,在现代生命科学的研究中,细胞工程是生物技术应用于产业一个技术公用平台,代表着现代生物工程最新的发展前沿,在医药、食品、农林等各领域发挥着越来越重要的作用,在高校生命学科及相关学科的课程设置中占有重要地位。动物细胞工程是细胞工程的重要组成部分,主要内容包括:细胞培养、细胞融合与单克隆抗体、胚胎工程、干细胞与组织工程、核移植技术与动物克隆、转基因动物与动物生物反应器和动物染色体工程等。通过学习动物细胞工程这门课程可以为学生今后从事与细胞工程有关的生物技术产业工作奠定良好的理论和技术基础。通过近两年的教学实践和改革,笔者就如何应用兴趣教学法提高学生学习效率和教学质量进行探讨。

1 合理定位课程,让学生充分认识到本课程的重要性

我校动物细胞工程这门课程是在第6个学期开设,学生已经完成对生物学导论、动物生物学、分子生物学、细胞生物学等必修课程的学习,这非常有利于学生对动物细胞工程课程中一些知识进行认知结构的迁移。而动物细胞工程在本校既然是选修课程,其教学目的也必然有别于必修课程。因此,教学目的的侧重点不再是让学生掌握一般的概念和原理,而是更多地让学生领悟和学会如何利用所学知识进行创造,让学生充分认识到动物细胞工程并非一门理论性学习为主的课程,而是一门理论和实践结合非常强的课程,是一门学好可以走向工作岗位的课程。笔者认为,在教授此课程时,需紧紧围绕细胞水平的技术创新和技术应用为中心,联系现代生物技术产业,使学生了解动物细胞工程各主要技术领域的原理和 方法 及其应用。

2 上好第一节课,吸引学生眼球

上好第一节课,也就为本课程的整个教学过程定下了基调。第一节课的内容无非是绪论部分,大多老师可能会对本课程的发展、地位等娓娓道来,但是却不能引起学生的兴趣,笔者尝试提问式教学代替讲述式教学收到了良好的效果。比如在讲述动物细胞工程的研究领域时,笔者就在教学PPT中列出“多莉”羊、 “人耳鼠”、“试管婴儿”、发光猫等图片尝试让学生对位入座,以激起学生的兴趣。

3 紧跟时代步伐,更新教学内容

目前细胞工程相关的教材有安利国版《细胞工程》(科学出版社)、杨吉成版《细胞工程》(化学工业出版社)、__勇版《细胞工程》(高等 教育 出版社)、庞俊兰版《细胞工程》、叙永华版《动物细胞工程》等,笔者所用的参考教材是安利国版《细胞工程》。虽然相关教材众多,但生物技术发展日新月异,教材的更新速度根本无法赶上,因此,必须及时查阅相关文献或信息,传授学生最新的知识。比如讲解胚胎工程可引入人类早期胚胎的成功培养;讲到转基因动物可引入中南大学的“供体猪”;讲到干细胞可以引入“人工肾”等。

4 以社会问题或社会需求为切入点传授理论知识

单纯理论的讲课效果,或者先理论讲解再到实际应用讲解的效果其实并不如从实际需求到理论讲解的效果好,因此笔者在讲解每个章节时尽量先引入社会问题或社会需求再来讲解理论知识,这样一来,学生课上的专注度明显提高,收到的讲课效果也非常好!比如在讲解细胞融合与单克隆抗体这章时,笔者就抛出杭州下沙企业期望与浙江高校合作解决的一些项目,其中就有不少抗体制备技术,这即刻引起学生的关注;比如在讲解干细胞这章节时,引入 “儿子严重烧伤 父亲拒用麻药割皮救子”的新闻事件,让学生重视干细胞研究的重要性;在讲解胚胎工程时,引入广州“代孕事件”。

5 合理利用多媒体技术

动物细胞工程是一门综合性很高的课程,传统的“粉笔+板书(或PPT)”的方式已经难以满足新形势下对这门课程教学的要求。现代教育技术在高等院校中已得到普及应用,通过多媒体技术,我们可以给学生展示除课本外更多的图片和视频信息,甚至可以直接在上课时在网上搜索相关信息给学生看。这些多媒体技术的应用在提高学生学习兴趣的同时,可以发散学生思维,不但可以补充书本内容,也可以提高学生对书本内容的学习效果。比如在讲解实验室的安全性时,可引入电影《生化危机》片段;在讲解细胞融合时,可引入《人兽杂交》这部电影;在讲解胚胎工程时,可辅以3D动画演示婴儿从受孕到诞生全过程;讲干细胞可引入“八戒的肝救活孙猴子”的新闻。每次课讲授时适当适量适时地引入一些多媒体图片、视频或动画信息,可以在上课之初即刻吊起学生对即将要学的知识的胃口,也可以在课中学生注意力不集中时再次把他们的注意力拉回来,多媒体图片或视频可以说是调动学生学习兴趣的一把利剑。但是这把利剑不能过度应用,否则就主次不分,学生把握不住重点,效果就会适得其反。

6 在讨论中实践实验

笔者所授的动物细胞工程有8个学时实验,实验内容为细胞培养的基本过程,基本为验证性实验,但这并不妨碍学生对知识的学习,这主要在于讨论式学习的引入。实验课之前,笔者在课堂上放映培养基过滤操作视频、细胞原代培养操作视频、小鼠心肌细胞培养操作视频等,让学生思考视频中实验人员的操作规范问题,让学生知道实验操作中的注意事项及其对实验结果的影响。在实验课中,引导学生对比实验前后结果,得出自己的结论,比如在做细胞培养基过滤实验时,教学生用倒置显微镜观察未过滤培养基的受污染情况,判断污染微生物的类型,从而让他们知道正确过滤的重要性以及如何处理受污染的培养基。

7 结语

动物细胞工程是一门综合性非常强的课程,唯有调动其学习的兴趣,学生才有学习积极性,才有可能得到好的教学效果。通过这两三年的兴趣教学法,笔者所教授的动物细胞工程深受学生喜爱,学生有时更简称笔者为“细胞老师”。当然,对于动物细胞工程课程,除了兴趣教学法外应当还有 其它 教学方法 与之相辅相成,共同达到良好的教学效果。

摘要对生物工程专业的动物细胞工程实验进行了开放式实验教学模式探讨,通过实验方案设计、方案讨论、实验操作、实验论文 报告 、实验 总结 等5个教学环节的实施,达到了较好的教学效果。同时分析了此种教学模式存在的问题与改进 措施 ,以为切实搞好开放实验教学活动提供参考。

关键词动物细胞工程;开放实验教学;教学模式;西南科技大学

AbstractThe opening experiment teaching mode in animal cell engineering experiment of bioengineering specialty was discussed in this paper. Five teaching links such as experiment project design,project discussion,experiment operation,experiment report andexperiment summary were actualized. The teaching effect was turned out fine. While,existing problems and improvement measures about this teaching mode were pointed out to provide reference for better opening experiment teaching.

Key wordsanimal cell engineering;opening experiment teaching;teaching mode;Southwest University of Science and Technology

西南科技大学地处四川省绵阳市,是中国西部的一所重点建设学校。西南科技大学生命科学与工程学院现共有7个专业,其中包括生物工程专业。由于生物工程专业是一门实验性、实践性非常强的学科,对该专业人才培养的要求是要具有较深厚的理论基础和较宽广的知识面,较强的实验、实践能力和创造能力。因此,笔者在优化理论教学的同时,也在积极思考如何加强生物工程专业的实验教学,强化实验与实践能力的训练,培养学生的动手能力,激励学生学习兴趣和创新精神,提高学生综合素质。传统的生物科学专业实验项目大多属于单一的验证性实验,且内容多是依附于各门课程的理论授课而开设,实验方法刻板,学生上实验只是被动应付、机械操作。这种“照方抓药”的实验形式极不利于学生智力的开发,限制了创造性思维的发展,不能充分调动学生的积极性和能动性。因此,生物工程专业的实验体系改革势在必行。近年来,西南科技大学加大了对本科教育的实验建设投入,大大改善了本科生实验条件。2010年,生命学院抓住学校迎接本科教学水平评估的契机,根据实际情况,申报了一个实验室建设项目“生物工程实验室建设”,得到了学校的批准并立项。在项目的实施过程中,不仅考虑了实验室软、硬条件的改善,同时也把实验教学模式的改革放到了重要的位置[1-2]。

1课程简介

《生物工程大实验》是生物工程专业的一门必修实验课,主要包括发酵工艺学、植物细胞工程、动物细胞工程3部分,在课程的教学过程中,动物细胞工程的实验周期相对稍短一些,同学们对动物细胞工程兴趣会更浓一些,因此,在动物细胞工程实验教学上应率先进行开放教学模式摸索。

2教学形式

教学共分为5部分内容,包括实验方案设计、方案讨论、实验操作、实验论文报告、实验总结。

实验方案设计

笔者在进行《动物细胞工程》理论教学中,发现学生对动物细胞培养特别感兴趣。利用学生的这种好奇心理,在课程结束时,安排学生做了一个实验方案设计——小鼠××细胞系的建立,该设计既是理论课程的一个结课报告,也是本实验的一个实验指导。为节省材料,将学生分成几个大组,每个大组8个人,然后每个大组再分成4个小组,每小组2个人。每个大组发放1只小白鼠,每个小组的学生根据自己的兴趣,可自由选择目的细胞,包括肌肉细胞、肾脏细胞、肝脏细胞、肺细胞、骨髓干细胞等。这样在一个大组内就可做不同的细胞,便于同学之间的相互交流和学习,同时也节约了材料。

该次实验方案是一个完整的有关动物细胞系建立的具体方案,包括实验准备工作、培养基的配制、原代细胞培养、细胞的纯化与传代、细胞生长曲线的测定、细胞的冻存与复苏。在方案中,要求学生详细写出实验目的、实验原理、实验材料、方法与过程及注意事项,这就要求学生认真思考自己所需要的材料,因为每组学生所做的细胞不同,采用的培养及纯化方法也不相同,所需要的材料也不相同,包括需要哪些药品、试剂怎样配制、需要多少吸管,甚至连废液缸都要考虑到。这样培养了学生的主动思考能力和积极参与性,而不再像以前一样由老师准备好所有器材,自己只需要按照老师指定的步骤,将老师已准备好的试剂一一的加进去即可。

方案讨论

方案设计好以后,教师进行修改,主要指出一些原则上的错误,让学生进行改进,然后进行交流。挑选一个比较典型的小组,向大家汇报,让同学来指出其设计上的不足,再在老师的指点下,比较自己的方案,这样在讨论中让学生对自己的目的和要求更加清晰。最后,给大家播放有关动物细胞培养方面的教学录像,详细介绍在操作中的注意事项,特别是一些细节问题,让同学们事先有所了解。

实验操作

大家的方案在讨论和看完录像后再一次进行修改,经老师修订同意后就可进行实验操作环节。学生按大组领用所需的器材,自己进行清洗、包装和灭菌处理,配制所需的试剂,按照设计的实验方案进行实验操作。在实验过程中,由于细胞生长的进度不同,同学们需要在不同的时间来进行处理。为解决这个矛盾,实验室采取了全天开放、学生预约登记的形式,保证学生可以在预定的时间进行实验。在实验进行过程中,要求学生每天来观察细胞生长情况。

实验论文报告

该实验报告采用科技论文报告的形式代替传统的实验报告,要求学生严格按照科技论文格式写出题目、前言、材料与方法、结果与分析、讨论与建议。前言部分要求学生简单介绍实验的原理与目的,由于动物细胞原代培养与细胞纯化的方法很多,多种方法大多可以使用,学生甚至可以同时使用不同的实验方法进行,但要求必须写出选择此方法的依据。材料与方法部分要尽可能详细,以锻炼学生自己动手准备实验的能力。实验结果要实事求是地记录下来。讨论为重点部分,要求结合理论知识对实验结果进行分析、综合、归纳和推理。若结果与预期不符,应分析原因,列出改进措施。最后,要求学生对此次实验教学提出自己的看法和意见。

实验 总结

课程结束后要对此次实验的情况进行总结,对出现的一些典型的情况进行分析。比如染菌严重等。分析其可能的染菌环节,及操作上的一些不正确的地方,让学生明白自己的不足之处。

3教学效果

此次开放实验教学,总体来说还是取得了较为满意的效果,与以前传统的实验教学方式相比,该教学主要达到了以下目的[3-4]:

真正做到了理论和实践相结合

由于《动物细胞工程》是一门理论与实践结合非常紧密的课程,在课程讲授过程中,会涉及到许多与实验操作有关的知识,而学生以前并没有相关知识的积累,讲解起来非常空洞。比如,在讲授原代细胞的制备方法中,会包括酶消化法和组织块法2种方法,这2种方法有何优缺点,应怎样根据实际情况进行选用等,这类知识教师通常在课堂讲授时只讲一些基本的理论知识,而具体情况需同学们通过自己的实践和相互交流就得到深刻的认识。

另外,由于要求学生自己动手设计实验方案,而方案的设计必须建立在踏实的理论知识基础上,这就要求学生在实验方案设计的同时,必须理清楚方案设计的理论依据,同时也培养了同学们查阅资料、阅读 文献的能力。

有效培养了学生的动手能力、思维能力,训练了从事科研工作的基本功

由于实验带教老师仅指出实验的名称,提供与本实验相关的实验器材、试剂、动物等,其余由学生通过阅读教材、查阅资料,明确实验目的、实验方法与步骤、注意事项等内容,并在此基础上按步骤进行操作。在教学过程中,学生始终处于主体位置,教师则处于主导位置。学生在实验中必须充分应用所学的理论和已掌握的技能,完成整个实验,包括实验的设计、操作的步骤、仪器和材料的选择、结果的分析等。其中每一步骤对学生来说都是全新的,充满了挑战性,试验结果不是预先知道的,学生必须对实验中出现的异常现象及时分析,并提出相应解决办法,这就要求学生要有严密的实验思路和严谨的 科学态度,调动学生的主动性。比如器材的清洗、包装、灭菌等工作,平时大家都不太重视,而通过实验,就有了切身体会,有的同学在做过滤除菌制备培养基时,由于无菌工作未作好,导致培养基染菌变浑浊而只能重做。由于各小组的实验材料和结果都不相同,也进一步拓宽了学生的知识面,充分挖掘了学生的创造才能,促进学生科学素质的提高,培养学生的综合能力。

实验结束后要求学生按照 论文的格式和规范撰写实验报告。对于普通高校的大多数学生来说,撰写论文是一件遥不可及的事情,现在他们具有了论文的素材,就可以模仿科技论文的写作要求去完成,使学生获得了撰写科研论文的训练,掌握了从事科研工作的基本功。

加强了老师和学生之间的交流,增进了师生感情

由于学生频繁出入实验室,与老师接触的时间增多,师生之间可广泛的进行交流,可以加深学生对老师的理解、对教师行业的尊重。

培养了责任心和科学态度,提高了兴趣,增强了自信心

实验分小组,做到任务到人,每个人对自己培养的细胞都爱护有加,这种负责任的心态是在做别的实验时看不到的。与以往实验不同,同学之间是用自己的劳动成果做比较,都格外努力。成功的同学根据自己的想法做设计、做实验,获到了很好的结果,会产生一种自豪感和自信心。而失败的同学虽然有一些丧气,但在认真总结教训和向成功同学取经的基础上,在第2次实验中还是会得到满意的结果。另外,由于实验过程中需要同学之间相互合作、协调进行,增进了同学的团结、互助、协调的精神。

提高了师资队伍水平和实验教学质量

开放式教学中一些实验内容反映了当代科学技术的 发展水平,涉及的知识面广。教师不仅要有本学科扎实的理论基础、较好的实验技能,还要加强业务学习,不断更新自己的知识,这在新实验开设和学生科技创新活动中显得尤其重要。可以说开放教学提高了师资队伍业务水平。从传统的实验教学到开放性实验教学的转变不仅对教学双方产生巨大影响,对提高实验室的建设和管理水平也会起到不可估量的作用,这种改革无疑会使实验室的各项工作发生质的飞跃。开放实验维护了学生的原创精神,能使学生在宽松的实验环境中实现从被动学习到主动学习的转变。可以说开放实验是实验教学中实现因材施教的必由之路,是培养学生创新能力的必备条件。

4存在的问题与改进措施

实验室配套设施不完善

由于实验人数剧增、延续时间较长,仪器设备接待能力明显不足。因为细胞培养严格要求无菌操作,所以,大部分操作都在超净台上进行,这样就造成对超净台需求的矛盾。而且,因为同学们大多是新手,操作时非常小心、谨慎,这样也常常导致不能按照预定的时间结束实验,设备流动速度慢,同学们等待时间较长。另外,由于学生人数多,人流量大,导致无菌室有名无实,也由此使一些同学的实验材料被污染。

增加了教师的实际工作量

设计性实验教学比单项实验教学工作量大、持续时间长。为了充分利用设备,缓解实验室设备紧张的压力,在一个规定的时间段,采用了学生预约、全天开放的实验模式。为了做好实验,同学们无论中午、晚上,只要有时间就可以到实验室做实验,由于学生以前没有受过这样的训练,教师必须随时在场给学生提供帮助,这就要求教师做出更多的奉献。另外,由于学生采用了各种各样的材料,教课老师需要查阅大量的资料,自己做一些预备实验,这样才能更好地指导学生。

加大了实验费用开支

实验要求学生自己准备实验材料和试剂,这比教师统一准备要消耗更多的实验试剂和材料,从而加大了实验费用开支。而且由于大家所采用的实验材料不一致,虽然老师在审阅设计方案时,取消了一些耗费较大的项目,但是仍然需要准备各种实验相关试剂和材料,也造成了实验开支的大大增加。

5结语

与课堂理论教学相比,实验教学更有利于培养学生的创新能力,实验室是让学生学会从实践中发现问题、解决问题和将所学知识运用到实际中去的重要场所,是培养具有创新能力的科学研究和应用人才的实践基地。而要真正上好实验课并非易事,综合性、设计性实验教学仍有待进一步完善。

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细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说,它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法,按照人们的设计蓝图,进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文,欢迎阅读。

【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架,并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架,冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后,用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全,其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性,并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示,羊膜上皮细胞在支架中分布均匀,生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架,其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。

【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性

近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限,去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2,3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4,5〕,促进神经元轴突的生长,是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架,并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内,探究两者的相容性,为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。

1 材料与方法

材料

实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司,SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。

方法

去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架,简述如下:取Wistar大鼠腹锯肌,放入蒸馏水中,在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中,摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液,摇床37℃,50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。

支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h,5%蔗糖90 min,15%蔗糖90 min,30%蔗糖过夜以梯度脱水,OCT包埋,冷丙酮速冻,之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片,HE 染色,观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。

人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素,200 μg/ml的谷氨酰胺),37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养,隔天换液,待单层培养细胞生长至80%汇合后,传代培养。

人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定

取生长良好的人羊膜上皮细胞,80%细胞接近融合,弃去培养液,胰蛋白酶消化,当胞体回缩,细胞间隙变宽时,用血清终止消化,反复轻吹瓶壁细胞,制成单细胞悬液于离心管中,1 000 r/min,离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液,以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中,在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养,隔天换液,培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L),继续培养1 d后,恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后,3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min,血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体,BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜,PBS 洗后,二抗37℃孵育30 min,PBS 洗后,SABC37℃孵育30 min,DAB显色。光镜下观察。

扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞,80%细胞接近融合时,用上述方法消化下来后,把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中,放在24孔板中,在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后,用2%戊二醛固定后,梯度乙醇脱水,CO2临界点干燥,镀膜,采用扫描电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看,肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整,支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分,胶原纤维为红色波浪状结构,弹性纤维为蓝色丝状结构,见图1。

羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2,HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好,分布均匀(图

图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色

图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示,BrdU阳性细胞数目多,提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示,支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒,呈棕褐色分布在细胞质中(图2C,2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示,在支架内部分布有大量细胞,细胞在支架中分布比较均匀,生长状态良好(图2E)。

3 讨 论

理想的支架材料应与细胞外基质类似,与活体细胞有良好的生物相容性〔7,8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势:(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用,研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕,它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕,该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉,静脉,神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果,发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的,而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9,12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白,并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布,其细胞外基质成分也是平行分布的,从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的,VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。

由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕,去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明,羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子,包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1,IL8 等因子,另外,还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞,与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀,抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力,并能表达BDNF和NT3,说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性,另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。

总之 ,本研究成功制备了去细胞肌肉支架,并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子,人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素,构成了良好的神经再生微环境,有利于使神经缺损得到较好地修复,为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。

【参考文献】

1 Mligiliche N,Kitada M,Ide of detergentdenatured skeletal muscles provides effective conduits for extension of regenerating axons in the rat sciatic nerve〔J〕.Arch Histol Cytol,2001;64 (1):2936.

2 Fansa H,Keilhoff G,Forster G,et muscle with Schwanncell implantation:an alternative biologic nerve conduit〔J〕.J Reconstr Microsurg,1999;15(7):5317.

3 Gulati AK,Rai DR,Ali influence of cultured Schwann cells on regeneration through acellular basal lamina grafts〔J〕.Brain Res,1995;705(12):11824.

4 朱 梅,陈 东,盂晓婷,等.羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病大鼠的实验研究〔J〕.中国老年学杂志,2006;26(2):2279.

5 Meng XT,Chen D,Dong ZY,et neural differentiation of neural stem cells and neurite growth by amniotic epithelial cells coculture〔J〕.Cell Biol Intern,2007;31:6918.

6 Brown AL,BrookAllred TT,Waddell JE,et acellular matrix as a substrate for studying in vitro bladder smooth muscleurothelial cell interactions〔J〕.Biomaterials,2005;26:52943.

7 Suh JK,Matthew of chitosanbased polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering:A review〔J〕.Biomaterials,2000;21(24):258998.

8 Grande DA,Halberstadt C,Naughton G,et of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts〔J〕.J Biomed Mater Res,1997;34(2):21120.

9 Fansa H,Schneider W,Wolf G,et responses after acellular muscle basal lamina allografting used as a matrix for tissue engineered nerve grafts〔J〕.Transplantation,2002;74(3):3817.

10 李培建,胥少汀.去细胞肌肉支架移植及神经生长因子对脊髓横断性损伤的修复作用〔J〕.中国脊柱脊髓杂志,2000;10(4):2203.

11 Fansa H,Keilhoff of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res,2004;26(2):16773.

12 Brown AL,Farhat W,Merguerian PA,et week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23:217990.

13 李培建,李兵仓,胥少汀.肌基膜管移植修复脊髓缺损的实验研究〔J〕.中华创伤杂志,2001;17(9):5258.

从简单地剪切致病基因,到开发出不再传播疾病的工程动物,基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入,科学界还发现,除了编辑具有遗传讯息的DNA片段,编辑RNA可以在不改变基因组的情况下,帮助调整基因表达方式,此外,RNA的寿命是相对短暂的,这也意味着它的变化是可以逆转的,从而避免基因工程中的巨大风险。

2017年10月,来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章,首次将CRISPR-Cas13系统公之于众,证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周,又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中,张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统,能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。

在CRISPR出现之前,RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性,而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说,并不是内源性的,因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反,RNAi利用内源性机制进行基因敲除,对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题,Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质,因此很难被包装到靶组织中,这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。

2018年3月16日,一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃,来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力,并将这个新系统命名为“CasRx”。

CasRx(品红色)在人类细胞核中靶向RNA(灰色),Salk研究所

“生物工程师就像自然界的侦探一样,在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程,我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示,“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中,这些RNA信息失去了平衡,因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”

除了高效性且无明显脱靶效应,新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要,这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体,并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究,他表示:“在这项研究中,研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用,我认为CasRx将成为非常有用的工具。”

此外,在这项研究中,研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中,并将其递送到利用额颞叶痴呆(FTD)患者干细胞中培养的神经细胞,最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上,有效率达到80%。

Patrick Hsu博士最后说道:“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中,其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭,但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来,这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用,并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”

该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合,通过尾静脉注射质粒的方式,将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中,成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。

3月18日,《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文,该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合,通过尾静脉注射质粒的方式,将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中,成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默,证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性,通过增强下游蛋白AKT的磷酸化,影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时,利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏,有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达,以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。

同时,杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作,也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性(AMD)的可能性,研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成(CNV)的面积,验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。

近年来,CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年,张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a,可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点,理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势,因而成为近年来的研究热点。2018年,加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比,Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性(与数百个shRNA脱靶相比,Cas13d没有脱靶)和敲除效率(Cas13d达到96%,shRNA达到65%)。而与Cas9介导的基因敲除技术相比,Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA,因此这种基因沉默是可逆的,从而对一些后天性疾病(如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病)的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小,效率高,被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性,杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性,为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性,研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选,然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析,分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调,Pcsk9下调造成血清胆固醇下调;Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成(CNV)的面积。

2020年3月18日,《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文,该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合,通过尾静脉注射质粒的方式,将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中,成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默, 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性, 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化,影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时,利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏, 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达,以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。

同时,杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作,也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性(AMD)的可能性,研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成(CNV)的面积**,验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。

近年来,CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年,张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a,可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点,理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势,因而成为近年来的研究热点。2018年,加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比,Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性(与数百个shRNA脱靶相比, Cas13d没有脱靶)和敲除效率(Cas13d达到96% ,shRNA达到65%)。而与Cas9介导的基因敲除技术相比, Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA,因此这种基因沉默是可逆的 ,从而对一些后天性疾病(如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病)的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小,效率高,被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性,杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性,为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性,研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选,然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析,分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调, Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调; Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成(CNV)的面积。

图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调( Protein & Cell )

A.质粒示意图;细胞中 Pten 的下调;检测PTEN及AKT的表达; 与shRNA脱靶比较;E.尾静脉注射质粒示意图;.免疫荧光,qPCR,western分别检测 Pten 及p-AKT的表达

图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控( Protein & Cell )

A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图;B.肝组织中 Pcsk9 的表达量;C.血清 PCSK9 的表达量;D.血清胆固醇水平;.血清ALT和AST的测定;G.可逆调节注射示意图; H. Pcsk9 的动态调控。

图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积(National Science Review)

A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图;.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ;蛋白的表达;病毒质粒示意图;F.实验流程图;的mRNA表达水平;.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平;诱导3天后的VEGFA蛋白水平;K.激光烧伤7天后,用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像;面积统计。

2020 年 4 月 8 日, Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文,该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。

该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达,首次在成体中实现了视神经节细胞的再生,并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时,该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元,并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。

人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中,神经元一般不会再生,一旦死亡,就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病,常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法,因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计,目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病,而且随着老龄化的加剧,神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。

在常见的神经性疾病中,视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类,它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界,是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路,而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。

作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁,视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡,急性的如缺血性视网膜病,慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计,仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。

帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡,从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前,全球有将近一千万人患有此病,我国尤为严重,占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元,一直是全世界众多科学家努力的方向。

该研究中,研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA,设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射,特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。

大约一个月后,研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞,并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。

研究人员进一步发现,转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系,并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中,研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。

为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能,研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元,并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。

在行为学测试中,研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能,从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。

需要指出的是,虽然科学家们在实验室里取得了重要进展,但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗,还有很多工作要做:人类的视神经节细胞能否再生?帕金森患者是否能通过该方法被治愈?这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。

(上)CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。

(中)视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞,转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系,并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。

(下)在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元,从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。

RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.

Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.

Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.

Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.

The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).

Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.

One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.

Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.

Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.

The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.

References

Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272

Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514

\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors

\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA

\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future

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