本科生毕业论文比对数据库

大学生论文联合比对数据库是什么？近几年很多本科论文需要查重，只会影响毕业。但是大部分本科毕业论文都是在网上拼凑整合，然后花钱去淘宝做本科论文查重。最让学生痛心的是，他们通过了淘宝知网的查重，却没能通过学校知网的查重系统！这是什么原因呢？paperfree小编给大家讲解一下。仔细分析，造成这个结果的原因主要有两个:①淘宝目前假货泛滥，学生购买假知识网络举报，导致差异较大，学生可以通过了解网络来验证真伪；②学生买便宜的知网期刊或知网分解，却抄袭高年级本科论文。今天主要分析第二个原因。对于本科生，本科院校基本采用“本科毕业论文抄袭检测系统”，也叫“中国知识网本科毕业论文管理系统”，简称“pmlc”。独有的“本科毕业论文联合比对数据库”可以检测本科大四学生的毕业论文。本科论文包含的数据库比较全面，和高校基本上一致！事实上，许多大学生因为大学生论文联合比对数据库中的重复文章而未能通过查重。大学生论文联合比对数据库主要包含本科高年级论文，即一年前通过知网pmlc系统查过的文章都会被记录下来。但是他在知网数据库里找不到！请注意，这是一年以前学长学姐的所有文章。所以现在用pmlc完全不会影响学校考试成绩！不用担心论文查重检测。

事实上，大学生论文比较数据库是与以往的大学生论文对比数据库。只要大学生的论文以前已经在学校查重系统检测过，这篇论文就会被纳入大学生论文联合对比数据库。在向学校提交毕业论文后，学校只提供了1-3次修改的机会。如果最终检测仍然不合格，它只能推迟到明年的毕业申请，所以学生只能再次写一篇新的毕业论文。此时，大学生论文联合对比数据库的功能将及时反映出来。事实上，大学生论文对比数据库是与以往的大学生论文进行比较。只要大学的论文抄袭过以前学长学姐的论文，就会被检测出来查重率。此时第一篇论文没有通过，推迟毕业学生注意，因为你的第一篇论文由于重复率或其他原因，只能重写论文，因为去年的论文包含在大学生论文联合比较库，如果你使用以前的论文，会导致你的文章相似比例很高，结果肯定不能通过。大学生论文的联合对比库也是近年来刚刚添加的。对于第一篇论文失败的学生来说，这确实增加了很多麻烦。因此，在这里，paperfree小编提醒学生在写论文时避免到处抄袭，认真负责地对待毕业论文。

pmlc是大学生论文抄袭检测系统又叫中国知网大学生论文管理系统，跟其他知网查重系统不同的是，PMLC特有”大学生论文联合比对库“可检测到往届学生的本科毕业论文。

1、大学生论文联合比对库是本科毕业生必查重的一个知网数据库，其主要收录的就是本科毕业论文，只要是往届毕业生使用过知网，pmlc都会在系统中有记录。由于学生并没有授权知网收录，这些文章都是不公开的私密论文。虽然知网查询下载不到这些论文，但是使用知网pmlc就可以对比到。所以本科生选择PMLC是最准确、最全面、和高校一致的查重系统。

2、高校学生在论文写作过程中，不可避免地要引用别人的成果和理论，少量合理的引用是允许的，但是只要论文与学校检测系统中的文章重复率超过学校规定范围，就会被视作抄袭，导致推迟答辩。现在论文上交学校之前，大学生在网上提前进行知网查重检测修改已经是必须也是普遍的现象了。

中国知网pmlc独有的大学生论文联合比对数据库主要收录了高年级本科生的毕业论文。检测范围很广，本科院校常用pmlc。中国知网pmlc查重:红色的都是重复的。修改后请给导师看。Pmlc检测范围:中国学术期刊网络出版数据库中国博士学位论文全文数据库/中国优秀硕士学位论文全文数据库中国重要会议论文全文数据库中国重要报纸全文数据库中国专利全文数据库【大学生论文联合比对库】互联网资源英文数据库(涵盖期刊、博士项目和会议的英文数据，德国的Springer和英国的Taylor

本科生毕业论文数据库

本科生毕业论文在中国知网可以查到。

本科毕业论文的收录一般只有两个地方有，一个是本校的数据库，另一个就是知网的数据库中。在本校学生是可以查阅到的，但是知网的数据库是我们不能查阅到的，这与知网的内部数据库有关。

知网收录本科论文的是其中专门检测本科论文的plmc检测系统，收录的数据库为“大学生论文联合对比库”，也就是使用plmc检测系统检测之后的所有论文都会被收录其中，但是由于没有和相关的作者签订合作协议，所以是不公开展示的，只会在检测的时候进行对比。

中国知网，始建于1999年6月，是中国核工业集团资本控股有限公司控股的同方股份有限公司旗下的学术平台。知网是国家知识基础设施（National Knowledge Infrastructure，NKI）的概念，由世界银行于1998年提出。

CNKI工程是以实现全社会知识资源传播共享与增值利用为目标的信息化建设项目。2019年5月，“科研诚信与学术规范”在线学习平台在中国知网正式上线发布。

并不是所有的毕业论文，知网数据库都会收录的。像本科毕业论文的话，一般会抽取评定为优秀毕业论文的入库。硕士以及研究生论文大部分都会收录，但主要还是看学校，有些学校收录的情况不同，不能一概而论。

如果抄袭往届学长学姐没有被知网收录的论文，会被检测出吗？

所有的毕业论文，学校会收录整理的，也就是学校本地的自建库。所以不要妄想抄袭往届学长学姐的论文，以为知网检测系统会查不到，就抱着侥幸心理通过的想法，像这些有案可查的，一定不要偷懒去投机取巧。

有些同学的文章被期刊发表后，这些文章是否被知网收录？又什么时候才能入知网数据库呢？

期刊里的文章是都要上传知网数据库的，一般由编辑部把电子版送到知网数据库，然后再经过一段时间生成特定电子版本的文件后，才能在知网上检索到。这个时间一般是三个月左右，每个期刊的上传的时间不同和数据库不同，所以没有准确的日期。

论文发表的过程是比较复杂的，每个环节都是需要注意的，可能哪个环节没有注意到就会影响到论文不能顺利的发表。论文发表审核就占据绝大部分的时间，所以提前根据论文要求撰写好论文，这样就可以节省一些时间。

本科生毕业论文联合对比库

《大学生联合对比库》本科毕业生用知网PMLC系统和知网大学生科研诚信系统，这两个系统都包含大学生联合对比库，同学对这个系统数据库知多少呢，《大学生联合对比库》是往届毕业的论文数据库，这里要说明一下，并非所有的毕业论文都会收录到这个数据库里面，毕竟大学生学术研究还不够深入更何况很多同学的毕业论文都是为了应付毕业而写得，学术研究成果可想而知了，所以系统在收录的时候会选择优秀的毕业论文，也就是说如果毕业论文不够优秀还不会收录到《大学生联合对比库》中。说的不好听如果您借鉴的是垃圾毕业论文系统就不会识别重复话说回来质量堪忧的毕业论文失去了借鉴的意义。《学术论文联合对比库》硕博毕业生用到知网（科研院所）和TMLC2（高校）检测系统，这两个系统只是使用单位不一样名称不一样，实际上数据库和检测算法是一样的，不想本科系统检测会有区别，所以同学不用担心检测结果不一样的问题。那么这两个系统收录的《学术论文联合对比库》又是什么数据库呢，这个数据库是上一届研究生学长用知网和TMLC2系统检测后自动收录的数据库，这个为什么是全部呢，相对大学生来说，研究生比大学生多少还是更有学术研究成果的，所以基本上都会收录防止同学抄袭。通过以上分享想必同学也会做到心中有数了，如何借鉴能顺利通过学校查重了。最后预祝大家顺利毕业，更多资讯关注paperfree官网，不仅在线查重还可以在线改重提升降重效率！

本科毕业生的毕业论文原则上都须通过万方“论文相似性检测服务”系统进行检测，特殊专业论文或者保密论文由学院（部）自定。

对于本科和硕士研究生毕业论文主要包括：封面、原创声明、摘要、目录、正文、致谢、参考文献、附录、开题报告和表格图片等，那么学校知网查重这些部分都会查吗？检测哪些内容更科学准确呢？下面学术不端网就来分析本科毕业论文查重哪些内容以及检测范围，具体答案分析如下：

关于知网相关抽查规定：有规定的，可以进行第一次修改，修改之后通过就可以答辩，如果第二次不通过就算结业，在之后4个月内还要交论文或者设计的。这个是在抄袭30%的基础上的。如果抄袭50%以上的话，直接结业在之后4个月内还要交论文或者设计的。

1、被认定为抄袭的本科毕业设计(论文)，包括与他人已有论文、著作重复总字数比例在30%至50%(含50%)之间的，需经本人修改。修改后经过再次检测合格后，方可参加学院答辩。再次检测后仍不合格的，按结业处理。须在3个月后提交改写完成的毕业设计(论文)，检测合格后再参加答辩。

2、被认定为抄袭的本科毕业设计(论文)，且与他人已有论文、著作重复总字数比例超过50%的，直接按结业处理。须在4个月后提交改写的毕业设计(论文)，检测合格后再参加答辩。

知网查重，就是用一定的算法将你的论文和知网数据库中已收录的论文进行对比，从而得出你论文中哪些部分涉嫌抄袭。目前的本科毕业论文查重使用的知网pmlc检测范围对比库有：

中国学术期刊网络出版总库

中国博士学位论文全文数据库/中国优秀硕士学位论文全文数据库

中国重要会议论文全文数据库

中国重要报纸全文数据库

中国专利全文数据库

大学生论文联合比对库

互联网资源(包含贴吧等论坛资源)

英文数据库(涵盖期刊、博硕、会议的英文数据以及德国Springer、英国Taylor&Francis期刊数据库等)

港澳台学术文献库

优先出版文献库

互联网文档资源

图书资源

CNKI大成编客-原创作品库

个人比对库

值得说明的是本科毕业论文查重的检测范围包括”大学生论文联合比对库”，该库是本科论文检测系统知网pmlc独有的对比库，主要记录本科学长毕业论文。学术不端网认为本科毕业论文知网查重主要内容包括：摘要、目录、正文、参考文献这几个部分内容。知网查重时具体查哪些内容最终还是要以学校要求为准，正确的目录和参考文献不影响知网查重结果，因为知网可以识别到目录和参考文献剔除并不参与正文检测。高校以知网查重为准，毕业论文定稿还是需要知网查重最准确。

论文查重对比的数据库

根据你的问题描述，首先一般论文查重都是控制在30％以内，像这种知网的发表的，严格在10％以内的相似度。

知网论文查重软件：知网在资源丰富方面具有突出的优势，其科学算法也使得论文的查重结果具有很高的权威性。万方论文查重软件:维普论文查重拥有优秀的自主研发算法，在数据库上也有突出的优势，比较资源可以用海量来形容。维普论文查重软件：维普论文检测系统是目前国内论文查重平台之一，采用AI智能比对技术，拥有丰富的本地文本资源库，致力于维护学术诚信，杜绝学术不端。paperfree论文查重软件：PaperFree论文查重软件通过海量数据库对提交论文进行对比分析，准确地查到论文中的潜在抄袭和不当引用，实现了对学术不端行为的检测服务。请点击输入图片描述

大学生在即将毕业的时候需要写完论文。大学会检查大学生提交论文的重复率。也就是将毕业论文上传到合作论文查重系统，查重系统将论文与系统收集的数据库资源进行比对，从而得出论文的查重率。查重率是学校初步判断论文合格与否的重要依据。大学生想提前查毕业论文应该去哪里查？一、在学校图书馆查重学校一般合作或自行开发的论文查重系统，很多学校与知网论文查重系统合作，通常为毕业生提供数量有限的免费论文查重。因此，大学生可以在学校图书馆登录校园网，找到查重入口，自行提交毕业论文，检测重复率。二、在网上找查重系统除了知网的论文查重系统，网上还有很多种类的论文查重系统。比如维普和万方，还有paperfree和papertime等论文查重系统，可以通过参与网站活动获得免费查重字数。你可以选择一个适合你论文的定期查重系统来提交你的论文进行测试。三、在手机上查重除了登录互联网在电脑上找到查重系统，大家还可以使用手机检测论文的重复率。很多论文查重系统都有微信公众号或者小程序，可以通过公众号和小程序提交论文进行查重。

paperfree数据库范围：学术期刊，学位论文，会议论文，互联网，英文数据库（涵盖期刊，硕博，会议的英文数据）。检测算法：公司自主研发的基于相似性哈希指纹对比算法。主要步骤有：文本预处理、哈希建索引、语义挖掘、深度识别等。

病毒数据库生物本科毕业论文

摘要目前，病毒已成为困扰计算机系统安全和网络发展的重要问题。掌握了计算机病毒的基本知识，一旦遇到计算机病毒就不会束手无策。本文通过对计算机病毒的概念、传播途径、感染后的症状等的介绍，使读者对其有一个理性的认识，并在此基础上提出了一些有效的防范措施，以期能最大限度地减少计算机病毒所带来的危害。关键词：计算机病毒传播途径防范措施大学生论文写作指导论文的选题方法毕业论文开题报告格式毕业论文开题报告注意... 毕业论文格式毕业论文注意事项 1 第一章什么是计算机病毒计算机病毒的定义中文名称：病毒英文名称：virus 定义1：计算机病毒(Computer Virus)在《中华人民共和国计算机信息系统安全保护条例》中被明确定义，病毒指“编制或者在计算机程序中插入的破坏计算机功能或者破坏数据，影响计算机使用并且能够自我复制的一组计算机指令或者程序代码”。而在一般教科书及通用资料中被定义为:利用计算机软件与硬件的缺陷，由被感染机内部发出的破坏计算机数据并影响计算机正常工作的一组指令集或程序代码。计算机病毒最早出现在70年代 David Gerrold 科幻小说 When . was One.最早科学定义出现在 1983:在Fred Cohen (南加大) 的博士论文 “计算机病毒实验”“一种能把自己(或经演变)注入其它程序的计算机程序”启动区病毒,宏(macro)病毒,脚本(script)病毒也是相同概念传播机制同生物病毒类似.生物病毒是把自己注入细胞之中. 定义2：计算机病毒是一个程序，一段可执行码。就像生物病毒一样，计算机病毒有独特的复制能力。计算机病毒可以很快地蔓延，又常常难以根除。它们能把自身附着在各种类型的文件上。当文件被复制或从一个用户传送到另一个用户时，它们就随同文件一起蔓延开来。计算机病毒的特征 (1)非授权可执行性用户通常调用执行一个程序时,把系统控制交给这个程序,并分配给他相应系统资源,如内存,从而使之能够运行完成用户的需求。因此程序执行的过程对用户是透明的。而计算机病毒是非法程序,正常用户是不会明知是病毒程序,而故意调用执行。但由于计算机病毒具有正常程序的一切特性:可存储性、可执行性。它隐藏在合法的程序或数据中,当用户运行正常程序时,病毒伺机窃取到系统的控制权,得以抢先运行,然而此时用户还认为在执行正常程序。 (2)隐蔽性计算机病毒是一种具有很高编程技巧、短小精悍的可执行程序。它通常粘附在正常程序之中或磁盘引导扇区中,或者磁盘上标为坏簇的扇区中,以及一些空闲概率较大的扇区中,这是它的非法可存储性。病毒想方设法隐藏自身,就是为了防止用户察觉。 (3)传染性传染性是计算机病毒最重要的特征,是判断一段程序代码是否为计算机病毒的依据。病毒程序一旦侵入计算机系统就开始搜索可以传染的程序或者磁介质,然后通过自我复制迅速传播。由于目前计算机网络日益发达,计算机病毒可以在极短的时间内,通过像 Internet这样的网络传遍世界。 (4)潜伏性计算机病毒具有依附于其他媒体而寄生的能力,这种媒体我们称之为计算机病毒的宿主。依靠病毒的寄生能力,病毒传染合法的程序和系统后,不立即发作,而是悄悄隐藏起来,然后在用户不察觉的情况下进行传染。这样,病毒的潜伏性越好,它在系统中存在的时间也就越长,病毒传染的范围也越广,其危害性也越大。计算机病毒 2 (5)表现性或破坏性无论何种病毒程序一旦侵入系统都会对操作系统的运行造成不同程度的影响。即使不直接产生破坏作用的病毒程序也要占用系统资源(如占用内存空间,占用磁盘存储空间以及系统运行时间等)。而绝大多数病毒程序要显示一些文字或图像,影响系统的正常运行,还有一些病毒程序删除文件,加密磁盘中的数据,甚至摧毁整个系统和数据,使之无法恢复,造成无可挽回的损失。因此,病毒程序的副作用轻者降低系统工作效率,重者导致系统崩溃、数据丢失。病毒程序的表现性或破坏性体现了病毒设计者的真正意图。 (6)可触发性计算机病毒一般都有一个或者几个触发条件。满足其触发条件或者激活病毒的传染机制,使之进行传染;或者激活病毒的表现部分或破坏部分。触发的实质是一种条件的控制,病毒程序可以依据设计者的要求,在一定条件下实施攻击。这个条件可以是敲入特定字符,使用特定文件,某个特定日期或特定时刻,或者是病毒内置的计数器达到一定次数等计算机病毒的结构 (1)触发模块:该模块通过判断预定的触发条件是否满足来控制病毒的感染和破坏活动。 (2)感染模块:该模块通过判断预定的触发条件是否满足来控制病毒的感染和破坏活动,控制感染和破坏动作的频率,使病毒在隐藏状态下进行感染和破坏活动。 (3)破坏模块:该模块包括破坏(或表现)条件的判断部分,判断是否破坏,表现或何时破坏。 (4)主控模块:病毒运行时,首先运行的是病毒的主控模块。主控模块控制病毒的运行。 (5)感染标志:当病毒感染宿主程序时,要把感染标志写入宿主程序,作为该程序已被感染的标志计算机病毒的分类一、计算机病毒按破坏性分，可分为:⑴良性病毒⑵恶性病毒⑶极恶性病毒⑷灾难性病毒二、按传染方式分 ⑴ 引导区型病毒,引导区型病毒主要通过软盘在操作系统中传播，感染引导区，蔓延到硬盘，并能感染到硬盘中的"主引导记录"。 ⑵ 文件型病毒,文件型病毒是文件感染者，也称为寄生病毒。它运行在计算机存储器中，通常感染扩展名为COM、EXE、SYS等类型的文件。 ⑶ 混合型病毒,混合型病毒具有引导区型病毒和文件型病毒两者的特点。 ⑷ 宏病毒,宏病毒是指用BASIC语言编写的病毒程序寄存在Office文档上的宏代码。宏病毒影响对文档的各种操作。三、按连接方式分 ⑴ 源码型病毒,它攻击高级语言编写的源程序，在源程序编译之前插入其中，并随源程序一起编译、连接成可执行文件。源码型病毒较为少见，亦难以编写。 ⑵ 入侵型病毒,入侵型病毒可用自身代替正常程序中的部分模块或堆栈区。因此这类病毒只攻击某些特定程序，针对性强。一般情况下也难以被发现，清除起来也较困难。 ⑶ 操作系统型病毒,操作系统型病毒可用其自身部分加入或替代操作系统的部分功能。因其直接感染操作系统，这类病毒的危害性也较大。计算机病毒 3 ⑷ 外壳型病毒,外壳型病毒通常将自身附在正常程序的开头或结尾，相当于给正常程序加了个外壳。大部份的文件型病毒都属于这一类。计算机病毒的入侵方式一、宏病毒宏病毒发作方式: 在Word打开病毒文档时，宏会接管计算机，然后将自己感染到其他文档，或直接删除文件等等。Word将宏和其他样式储存在模板中，因此病毒总是把文档转换成模板再储存它们的宏。这样的结果是某些Word版本会强迫你将感染的文档储存在模板中。防范措施:平时最好不要几个人共用一个Office程序，要加载实时的病毒防护功能。病毒的变种可以附带在邮件的附件里，在用户打开邮件或预览邮件的时候执行，应该留意。一般的杀毒软件都可以清除宏病毒。二、CIH病毒发作破坏方式:主要是通过篡改主板BIOS里的数据，造成电脑开机就黑屏，从而让用户无法进行任何数据抢救和杀毒的操作。CIH的变种能在网络上通过捆绑其他程序或是邮件附件传播，并且常常删除硬盘上的文件及破坏硬盘的分区表。所以CIH 发作以后，即使换了主板或其他电脑引导系统，如果没有正确的分区表备份，染毒的硬盘上特别是其C分区的数据挽回的机会很少。防范措施:已经有很多CIH免疫程序诞生了，包括病毒制作者本人写的免疫程序。一般运行了免疫程序就可以不怕CIH了。如果已经中毒，但尚未发作，记得先备份硬盘分区表和引导区数据再进行查杀，以免杀毒失败造成硬盘无法自举。。四、木马病毒木马病毒源自古希腊特洛伊战争中著名的“木马计”而得名，顾名思义就是一种伪装潜伏的网络病毒，等待时机成熟就出来害人。防范措施:用户提高警惕，不下载和运行来历不明的程序，对于不明来历的邮件附件也不要随意打开。计算机病毒的传播计算机病毒的传染分两种。一种是在一定条件下方可进行传染, 即条件传染。另一种是对一种传染对象的反复传染即无条件传染。从目前蔓延传播病毒来看所谓条件传染, 是指一些病毒在传染过程中, 在被传染的系统中的特定位置上打上自己特有的示志。这一病毒在再次攻击这一系统时, 发现有自己的标志则不再进行传染, 如果是一个新的系统或软件, 首先读特定位置的值, 并进行判断, 如果发现读出的值与自己标识不一致, 则对这一系统或应用程序, 或数据盘进行传染, 这是一种情况；另一种情况, 有的病毒通过对文件的类型来判断是否进行传染, 如黑色星期五病毒只感染.COM或.EXE文件等等；还有一种情况有的病毒是以计算机系统的某些设备为判断条件来决定是否感染。例如大麻病毒可以感染硬盘, 又可以感染软盘, 但对B驱动器的软盘进行读写操作时不传染。但我们也发现有的病毒对传染对象反复传染。例如黑色星期五病毒只要发现.EXE文件就进行一次传染, 再运行再进行传染反复进行下去。可见有条件时病毒能传染, 无条件时病毒也可以进行传染

你好，计算机病毒的预防和诊断的毕业论文

随着Internet的迅速发展我国的互联网用户不断的增加，成为仅次于美国的国家，位居世界第二。互联网的发展也使得计算机病毒开始渗透到信息社会的各个领域，给计算机网络系统带来了巨大的破坏和潜在的威胁。为了确保信息的安全与畅通，研究计算机病毒的防范措施已迫在眉睫。计算机病毒的防治目前主要有主动防御技术和启发式病毒扫描技术等，也在朝着一些新的趋势发展。【目前主要有主动防御技术和启发式病毒扫描技术等。本文将从计算机的特点入手，来探讨对付计算机病毒维护计算机网络安全的方法和措施。

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【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参考文献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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