甲状腺肿瘤占所有肿瘤的1%，其中大部分为内分泌恶性肿瘤[1]，并且其发生率在近几年快速增加[2]，尤其是甲状腺乳头状癌(PTC)[1]。PTC的男女发病率之比为1∶4，提示雌激素在PTC的发生发展中可能具有重要作用，雌激素经典的信号通路是由两个细胞内受体介导的，即雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)。而基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达异常与人类恶性肿瘤的浸润与转移密切相关[3]。为了研究ERα、ERβ对人类PTC中癌细胞的迁移和侵袭的影响，我们采用免疫组织化学(免疫组化)法检测ERα、ERβ和MMP-9在200例PTC组织和100例结节性甲状腺肿(NTG)中的表达，探讨三者与PTC临床病理特征之间的关系。

一是建立政策支持体系，通过逐步完善绿色债券的财税优惠、补贴支持、信息披露、政府担保等方面的政策体系，从顶层设计角度构建政府主导的绿色债券政策支持体系。二是促进绿色债券国内标准与国际标准对接，在统一国内标准基础上，加快与国际标准接轨，逐步达成统一共识，提高认证评估结果权威性和可比性。三是完善绿色债券第三方认证体系，强化认证、监督和管理，提高评估科学性和规范程度，培育和发展本土化的第三方认证机构，不断提升我国绿色债券在国际市场中的地位。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2003年6月至2016年7月间天津市武清区人民医院病理科常规外检的200例PTC和100例NTG患者切除的组织包埋块。其中PTC患者中男性47例，女性153例；年龄范围25～60岁，中位年龄45岁；肿瘤≥2 cm者86例，<2 cm者114例；有包膜侵犯者107例，无包膜侵犯者93例；有淋巴结转移者79例，无淋巴结转移者121例；根据TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期134例，Ⅲ～Ⅳ期66例。所有病例在肿瘤切除前均未进行放疗和化疗。所有病例均经两位副主任医师以上病理医师阅片明确诊断为PTC和NTG。

本研究经天津市武清区人民医院医学伦理委员会批准，患者及其近亲属知情同意。

本课题主要探讨辊壳式流浆箱在不同喷浆速度下所需的均衡室进口压力和溢流室压力，并不对单根纤维的受力和定向进行研究，而且流浆箱上网的浆料浓度较低(约0.6%)，其流动特性与水类似[7]。利用两种不同密度和黏度的流体模拟水和纤维的流动，主相水密度为998 kg/m3，黏度0.001003 kg/(m·s)，第二相密度设为980 kg/m3，黏度为0.000897 kg/(m·s)，质量分数设为0.6%，其他物理指标与水相同，两者均匀混合。

1.2 研究方法 免疫组化Elivision两步法 将准备好的石蜡组织块，切成石蜡切片，置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脱蜡至水，用pH 7.4的PBS冲洗3次，每次3 min。取一定量pH 6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10 min，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2次，每次3 min。每张切片加1滴3%双氧水，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体，室温下孵育2 h。PBS冲洗3次，每次5 min。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min。PBS冲洗3次，每次3 min。除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min。PBS冲洗3次，每次5 min。除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5 min。苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

1.3 材料与试剂 单克隆兔抗人ERα抗体为abcam公司产品，工作液浓度为1∶100；单克隆兔抗人ERβ抗体为abcam公司产品，工作液浓度为1∶200；单克隆兔抗人MMP-9抗体为abcam公司产品，工作液浓度为1∶200。即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司。操作严格按照试剂盒说明书进行，用已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 ERα蛋白主要表达于细胞核，ERβ蛋白主要表达于细胞核和细胞质，MMP-9主要表达于细胞质和细胞膜，以出现棕黄色颗粒染色为阳性。根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和对组织切片中各点评分。染色强度定性积分：不着色为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；染色面积定量积分：无着色或<5%为0，5%～<24%为1，25%～<50%为2，≥50%为3；两种积分相加为该点得分。两项得分相加为总积分，依照0为-，1～2为+，3～4为++，5～6为+++，进行半定量判断；>2(++和+++)为阳性，≤2(-和+)为阴性进行定性判断。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件包进行数据分析。计数资料用例(%)表示，组间比较采用χ2 检验。采用Spearman等级相关分析进行相关性研究。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERα、ERβ和MMP-9在PTC组织及NTG组织中的表达 ERα阳性着色位于细胞核(图1)，ERβ阳性着色位于细胞核和细胞质(图2)，MMP9阳性着色位于细胞质和细胞膜(图3)。

在PTC及NTG组织中，ERα的阳性表达率分别为56.00%(112/200)和8.00%(8/100)，其差异有统计学意义(P<0.01)；ERβ的阳性表达率分别为70.00%(140/200)和 58.00%(58/100)，其差异有统计学意义(P<0.01)；MMP-9的阳性表达率分别为82.00%(164/200)和65.00%(65/100)，其差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 PTC和NTG组织中ERα、ERβ和MMP-9的阳性表达率的比较/例(%)

组别例数ERα(+)ERβ(+)MMP-9(+)PTC200112(56.00)140(70.00)164(82.00)NTG1008(8.00)58(58.00)65(65.00)χ2 值64.0004.27810.665P值<0.01<0.01<0.01

注：ERα为雌激素受体α、ERβ为雌激素受体β、MMP-9为基质金属蛋白酶-9、PTC为人甲状腺乳头状癌、NTG为结节性甲状腺肿

2.2 在PTC中ERα、ERβ和MMP-9的表达与临床病理特征间的关系 在PTC中，ERα蛋白的阳性表达率与患者的性别有关，其在女性患者中的表达明显高于男性患者(P<0.01)。MMP-9的阳性表达率与肿瘤的包膜侵犯有关，在已侵犯肿瘤包膜的肿瘤中的表达高于无包膜侵犯的肿瘤(P<0.01)。MMP-9的阳性表达率与是否有淋巴结转移有关，在有淋巴结转移组中的表达阳性率高于无淋巴结转移组 (P<0.05)。MMP-9的阳性表达率还与TNM分期有关，随着TNM分期的进展呈上升趋势，在Ⅰ和Ⅱ期中的表达阳性率低于Ⅲ和Ⅳ期(P<0.05)。ERα蛋白的阳性表达率与肿瘤大小、包膜侵犯、淋巴结转移及TNM分期无关(P>0.05)。ERβ蛋白的阳性表达率与患者性别、肿瘤大小、包膜侵犯、淋巴结转移及TNM分期无关(P>0.05)。MMP9的阳性表达率与患者性别和肿瘤大小无关(P>0.05)。见表2。

2.3 在PTC中ERα、ERβ和MMP-9之间的相关关系 Spearman等级相关分析显示，在PTC组织中，ERα蛋白的阳性表达率和MMP-9蛋白的阳性表达率呈正相关关系(r=0.573，P<0.01)，ERβ蛋白的阳性表达率和MMP-9蛋白的阳性表达率呈负相关关系(r=-0.520，P<0.01)。

3 讨论

有研究显示ERα与ERβ对细胞的生存和增殖有相反的作用，ERα具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，而ERβ却显示了在分化和促进细胞凋亡中的作用[6]。本研究中ERα在PTC中的表达远远高于其在NTG中的表达，与 Chen等[6]研究一致。这进一步表明在PTC中，ERα是一个重要的细胞增殖指标，它的高表达刺激了肿瘤细胞的生长。本研究中ERβ在PTC中的表达高于其在NTG中的表达，与Chen等[6]研究结果不同，这可能是因为ERβ亚细胞定位的不同所引起，Chen等[6]对ERβ的结论是基于其在细胞核的表达，而本研究中其主要在细胞核和细胞质同时表达。在浸润性食管癌中ERβ在细胞质的表达明显高于在非浸润性食管癌；在乳腺癌中，ERβ细胞核的高表达时，其内分泌治疗有效，预后相对较好[7]。因此推测ERβ在不同部位的表达其作用是不同的。

这种争议可能是因为雌激素受体的亚细胞定位判断的不同引起的，另外则是采用不同的实验方法、技术及统计方法等因素造成的。本研究中运用免疫组化的方法，结果显示在PTC和NTG中，ERα表达于细胞核，而ERβ则表达于细胞核和细胞质中。

雌激素受体在甲状腺组织中的表达首次报道于1981年，Molteni等[4]通过使用符号定向图(SDG)法证实甲状腺乳头状癌组织中有雌激素受体表达。目前国内外研究对于PTC和NTG组织中ERα和ERβ的表达仍有争议，有大量的证据表明PTC和NTG组织中存在ERα和ERβ的表达，但仍有个别研究在PTC和NTG中未检测到ERα和ERβ的表达[5]。

表2 PTC中ERα、ERβ和MMP-9的表达与临床病理特征间的关系

临床特征例数ERα阳性率/%χ2 值P值ERβ阳性率/%χ2 值P值MMP-9阳性率/%χ2 值P值性别12.0200.0010.4780.489 0.4470.504 男4734.0465.9678.72 女15362.7571.2483.01肿瘤大小1.221 0.2692.6270.1050.032 0.858 ≥2 cm8660.4763.9582.56 <2 cm11452.6374.5681.58包膜侵犯1.3570.244 0.9200.338 11.676 0.001 阳性10759.8172.9090.65 阴性9351.6166.6772.04淋巴结转移3.0130.0830.726 0.394 5.484 0.019 阳性7949.3773.4289.87 阴性12160.3367.7776.86TNM分期1.4980.2212.4810.1155.297 0.021 Ⅰ和Ⅱ期 13452.9966.4277.61 Ⅲ和Ⅳ期 6662.1277.2790.91

注：ERα为雌激素受体α、ERβ为雌激素受体β、MMP-9为基质金属蛋白酶-9、PTC为人甲状腺乳头状癌

PTC存在明显性别差异，本研究显示ERα在女性中的表达明显高于男性。Zhang等[8]研究发现，雌激素可以促进人甲状腺癌乳头状细胞株(BCPAP)和正常甲状腺细胞株生长，并且雌激素能够促进甲状腺癌细胞的粘连、侵袭和转移。但是本研究PTC中ERα和ERβ的表达与PTC患者的肿瘤大小、包膜侵犯、淋巴结转移状况及TNM分期无关，与Huang 等[9]报道结论相一致，推测ERα和ERβ仅仅参与了雌激素促进PTC发生的过程中，而没有或很少参与其进展。

肿瘤细胞浸润转移的关键步骤之一是细胞外基质的降解，MMP-9是重要的细胞外基质降解酶，能通过促进血管生成和降解细胞外基质，使肿瘤发生浸润、转移[3]。在本研究中，MMP-9蛋白在PTC中高表达，且在已侵犯肿瘤包膜的肿瘤中的表达高于无包膜侵犯的肿瘤，在无淋巴结转移组中的表达阳性率高于有淋巴结转移组，随着TNM分期的进展呈上升趋势，在Ⅰ和Ⅱ期中的表达阳性率低于Ⅲ和Ⅳ期。有研究证实，在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中，ERα表达水平与MMP-9呈正相关[10]； 有学者发现ER激动剂能够通过ERα依赖通路促进卵巢癌细胞转移，通过ERβ抑制其转移[11]。本研究结果中MMP-9与ERα蛋白的阳性表达呈显著正相关，与ERβ蛋白的阳性表达呈显著负相关。尽管本研究与已有的文献报道的发生部位不同，但相应地可以因此推测，ERα和ERβ在PTC肿瘤细胞的浸润转移机制类似于卵巢癌。当然具体的通路还需要进一步研究。

本研究结果证实，在PTC中，ERα对PTC的发生发展有重要的促进作用，ERβ的亚细胞定位对其在PTC中所起的作用非常重要，而这两者与MMP-9之间存在着紧密的联系，或许可以为PTC的个体化治疗提供新的线索。

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