鸡球虫病是由艾美耳科艾美耳属的一种或几种球虫寄生于鸡的肠道不同部位引起以腹泻、血便、生长迟缓、饲料转化率降低、死亡为特征的寄生原虫病，尤以寄生于盲肠的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)致病力最强，每年全世界因该病造成的损失高达80亿美元[1]。目前，对鸡球虫病的防治主要以化学药物为主，但由于用药不规范使得产生耐药虫株的时间越来越短，长期用药也让消费者越来越关注药物残留问题，使得鸡球虫病的防治也逐渐从药物控制转变为免疫预防，而传统的球虫疫苗包括强毒活疫苗和弱毒苗，因安全性差、免疫效果不理想等因素而得不到广泛应用[2]。核酸疫苗是近几年发展起来的，由于外源DNA和宿主的染色体不会发生整合，对宿主细胞无损伤，具有高效、安全、稳定、易于制备等特点[3]。鸡球虫核酸疫苗研究比较晚，但随着球虫保护性抗原基因的发现[4]，鸡球虫核酸疫苗为鸡球虫病的防治开辟了新途径。目前研究的球虫种类主要包括柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、堆型艾美耳球虫( E.acervulina)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)。

1 鸡球虫核酸疫苗的研究现状

鸡球虫生活史复杂，基因组庞大，裂殖子阶段和子孢子阶段的免疫活性和抗原构成均存在一定的差异，利用特异性抗体及探针筛选技术对抗原基因进行克隆，并连接载体制成免疫制剂，通过接种进入机体产生作用。抗原的免疫原性决定着疫苗保护作用的强弱，因此，寻找具有免疫功能的保护性抗原，是完成基因疫苗研究的前提。据估计，鸡球虫有30万个基因，用于研究的抗原基因也有很多，主要有重组抗原、子孢子抗原表面、裂殖子表面抗原、微线蛋白、折光体蛋白。国内外学者对这些保护性抗原基因的免疫效果进行了广泛研究。其中E.tenella的抗原基因有5401[5]，SO7[6]，EtMIC1[7]，EtMIC2[8]，EtMIC4[9]，EtMIC5，WF-Ⅰ，WF-Ⅱ[10]，GX3262，Et7b2，EtlA1，Etrop/5[11～14]，EtS3a[15]等基因。E.acervulina的抗原基因有3-1E[16]，9S4，EalA，MA1[17]，EAMZp30-40，MA16[18]等基因。E.maxima的抗原基因有Em70/2，GAM56，GAM82[19]等基因。E.necatrix的抗原基因有Engam59[20]，gam22[21]，SNF2[22]等基因。E.praecox的抗原基因有ITS-1，ITS-2[23]等基因。经学者研究表明，这些基因所编码的抗原蛋白都具有很好的免疫原性，是制备核酸疫苗的侯选基因，为球虫核酸疫苗的研究奠定了基础。

试验设置为小区对比试验，设置6个处理（表2），每个处理重复3次，共18个小区，每个小区的面积为21 m2（3 m×7 m）。各小区随机排布，各个小区之间设1 m隔离行，并采用田埂方式将各小区分隔开，防止各小区间出现串水现象。100%化肥处理中年纯氮施用量为 450 kg·hm-2，茶园中N∶P2O5∶K2O 的施用比例为 3∶1∶2；各处理施肥种类与施肥量如表2，不同处理中N、P2O5、K2O施用量及施用比例见表 3。各个小区水分管理、病虫害防治等管理措施相同，保证茶树正常生长。

2 核酸疫苗免疫的作用机理

核酸疫苗也称基因疫苗，是将含有编码抗原基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，被宿主细胞(组织细胞、抗原递呈细胞或其它炎性细胞)摄取，并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫[24]。随着分子生物学研究的发展，核酸疫苗的研究取得了一定的成就。但到目前为止，核酸疫苗免疫的作用机理尚不清楚，但有研究表明，DNA 质粒进入宿主细胞后，抗原的基因片段可以在宿主细胞内表达并合成抗原，随后经过加工、处理、修饰等过程递呈给免疫系统，可以全面引发机体的免疫应答反应。核酸疫苗接种后，一部分抗原蛋白与MHC-Ⅰ类分子结合，形成抗原肽-MHC-Ⅰ分子复合物，被识别，经活化、增殖、分化为具有杀伤能力的Tc，诱导产生细胞免疫反应[25]。而另一部分抗原蛋白进入MHC Ⅱ类途径，疫苗基因表达的产物没有经过加工直接被释放出去，与MHC Ⅱ类分子结合由T细胞细胞受体识别，产生抗体诱导产生体液免疫应答[8]。

在杭州市卫生计生委部署之下，杭州市第一人民医院较早就引入电话预约、网络预约等挂号方式。不过，当时的预约更像是把线下排队挂号搬到网上，拿到一个排队码，并没有把预约精准化。患者拿到预约号之后，尽管不用起大早来医院排队，但是还要在开诊前后赶到医院拿号，依然还要在诊室门口排队等候，等着叫号。

3 鸡球虫核酸疫苗的免疫效果评价

疫苗免疫接种后，抗原进入机体刺激机体产生免疫应答。有实验表明，不同剂量对免疫效果有一定的影响，最初抗原的用量越多，免疫应答效果越好，但当达到一定量时，免疫效果反而比小剂量时抗体的效价更低。张广霞等[44]应用不同剂量的猪瘟疫苗对猪的保护效力进行研究，结果发现，1头份剂量就可产生良好的免疫效果；当加大到2～4头份，可以提高免疫效果；但当免疫剂量加大到6头份时， 免疫效果会降低。因此，在免疫接种时不可任意加大抗原用量。

4 细胞因子对球虫核酸疫苗免疫效果的影响

可见，鸡IL-2和IFN-γ在抗球虫感染中发挥着重要的作用，将其与球虫抗原基因联合插到DNA疫苗载体中构建免疫调节型DNA疫苗，其所产生的免疫保护效果明显优于单独构建的DNA疫苗。

同样，有学者对IFN-γ进行了深入的研究，IFN-γ是唯一的Ⅱ型干扰素，是由活化的T细胞、B淋巴细胞和NK细胞产生，参与先天和获得性免疫应答的细胞因子，存在于被刺激淋巴细胞上清液中，具有广泛的免疫调节活性[39]，可刺激机体的NK细胞并增强细胞的杀伤功能，促进细胞分泌抗体，从而提高机体的免疫功能。有实验表明，它与鸡球虫的免疫有关。谢昆等[40]构建了pVAX1.0-pEtK2，pVAX1.0-pEtK2-IFN-γ，pcDNA4.0(c)-pEtK2，pcDNA4.0(c)-pEtK2-IFN-γ等4种重组质粒，对鸡进行免疫保护性实验。结果表明： pVAX1.0-pEtK2-IFN-γ，pcDNA4.0(c)-pEtK2-IFN-γ组卵囊产量分别为36.07%和23.42%，盲肠病变记分分别为0.9和0.4，相对增质量率分别为87.96%和95.26%，ACI达到182.82和193.86，免疫保护效果明显优于其它试验组，说明鸡IFN-γ对DNA疫苗具有免疫增强作用。徐守振等[41]将鸡E.tenella的3-1E抗原基因与IFN-γ进行融合，扩增出IFN-γ/3-1E融合基因，连接载体proVAX构建融合表达质粒proIE，通过IFA检测proI，proE，proIE重组质粒在细胞的蛋白表达情况；将重组质粒进行动物保护性实验。结果显示，与proE和proI相比，proIE融合DNA疫苗具有增强免疫保护作用，可显著降低卵囊排出量达10.6×108个。

IL-2是由T淋巴细胞产生，可促进哺乳类动物B细胞、T细胞的增殖、分化，还可以增强单核细胞和NK细胞的杀伤活性，在免疫系统具有十分重要的免疫生理调节效应，甚至可对神经系统发挥免疫调节作用[36]。张云霞等[37]用重组植物乳杆菌活载体疫苗NC8-pSIP409-TA4与NC8-pSIP409-IL-2联合，结果显示，联合组相对增质量提高，盲肠病变减轻，淋巴细胞增殖23.4%。表明IL-2可以作为免疫佐剂增强活载体疫苗的免疫效果。谢昆等[38]报道，E.tenella免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2，pcDNA-4.0-EtK2-IL-2的免疫保护效果明显优于pEt-28a-pEtK2重组蛋白和重组质粒pVAXI-pEtK2组，ACI分别达181.0和192.8。

近年来，对细胞因子的研究报道越来越多，并发现细胞因子在免疫调节和抗感染免疫中具有重要作用[33～35]。细胞因子有很多种，如白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-17(IL-17)，干扰素-γ(IFN-γ)等。其中研究最多的是IL-2和IFN-γ。

5 影响球虫核酸疫苗免疫效果的因素

5.1 载体

载体质粒是编码保护性抗原基因表达抗原的工具，它的结构和组成对疫苗的免疫原性有显著影响。作为疫苗载体必须具备以下特点：(1)本身不复制；(2)不会整合到宿主染色体中；(3)可以在机体细胞内高水平表达目的基因。常用的真核表达载体主要有pPIC9，pPIC9k，pcDNA4.0，pAO815，pPIC6A，pPIC6aA，pSV2，pRSV，pcDNA3.1，pCI和pVAX1。其中常用的有pPIC9，pVAX1，pcDNA3.0，pcDNA3.1，pcDNA4.0。pPIC9是毕赤酵母蛋白表达载体，是一种融合表达载体。pcDNA3.0是一种常用的哺乳动物的表达载体，具有氨苄青霉素抗性，表达效果好。pcDNA3.1是在pcDNA3.0的基础了加上了HIS标签，方便表达后对蛋白的鉴定，也是一种表达效果很好的载体。pcDNA4.0既是哺乳动物的表达载体，也是cDNA表达载体，具有高拷贝性，携带His Tag (C-端)，c-Myc Epitope Tag(C-端)两种标签。pVAX1载体是pcDNA3.1载体经过改造后开发的，符合疫苗指导规范的有关要求，目前认为是较为安全的疫苗载体[42]。扈炳新[43]分别构建了重组原核表达质粒pET-32a(+)-3-1E和重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E，分别对鸡只进行免疫，结果显示，其ACI分别为171.45和181.04，说明重组真核表达质粒的抗球虫作用较为明显，为最终的实际应用奠定了基础。

5.2 免疫接种剂量

鸡球虫核酸疫苗是将具有免疫原性的蛋白抗原基因与载体构成重组质粒，用此质粒免疫鸡，蛋白抗原基因在鸡体内表达，被免疫系统识别从而达到免疫保护效果[26]。Kapczynski等研制了同时编码几种蛋白(IBV S1，N，和M)的保护性DNA疫苗，结果表明，疫苗增强了细胞免疫和体液免疫的保护效果，但仍需灭活疫苗才能加强免疫获得较好的免疫保护率[27，28]。Du等[29]利用减毒沙门氏菌为载体，构建了E. tenella 5401基因的重组质粒pcDNA3-5401进行试验，显示重组沙门氏菌可以诱导机体产生抗体，对淋巴细胞增殖也有显著的增强作用，抗球虫指数(ACI)可达164.98。张杰等[30]构建了pCTCON2-EtMIC2载体，动物保护性试验表明最终表达的EtMIC-2 蛋白质表现出良好的免疫原性，细胞因子和抗体水平显著提高。Kopko S H等[31]用构建了pcDNA3-SO7质粒免疫雏鸡，与球虫活疫苗和SO7免疫比较，其盲肠病变减轻，相对体质量增加10%。Yang等[32]从鸡球虫中筛选出一株鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid。经CEF进一步扩增后对雏鸡进行免疫，剂量为102 PFU，104 PFU或106 PFU，结果发现，接种重组病毒的鸡外周血中的含量和体质量显著高于非免疫对照组，对E. tenella攻击的免疫保护力分别为39.6%，41.1%或41.7%。

5.3 免疫接种途径

疫苗免疫接种途径有很多种，比如滴鼻点眼、口服、拌料、喷雾、注射等。以新城疫疫苗为例，肌肉注射组在早期的抗体滴度低于点眼组，但肌注的抗体维持时间长，稳定性比其他方式强[45]。张锦余等[46]针对猪流行性腹泻病采用不同的免疫途径进行免疫，结果显示，口服免疫比肌肉注射免疫效果好。交巢穴注射免疫具有免疫放大作用，效果比口服和肌肉注射好。因此，选取合适的免疫接种途径可以使免疫效果达到最好。

通过监测分析石化企业中一台驱动离心压缩机组的汽轮机，设计工作转速6 500r/min，一阶临界转速：4 020r/min，二阶临界转速：8 150r/min，多块可倾滑动轴瓦，迷宫密封，入口蒸汽压力：3.8MPa，出口蒸汽压力：0.008MPa，振动报警值—峰峰值38μm，振动停机值-峰峰值65μm。

蟋蟀在堂，岁聿其逝。 今我不乐，日月其迈。 无已太康，职思其外。 好乐无荒，良士蹶蹶。 (蹶蹶，劳动的样子。)

6 展 望

核酸疫苗具有独特的诱发机制，使机体产生高水平细胞免疫及体液免疫反应能力，倍受学者们的青睐。随着对球虫入侵机制的深入研究，借助免疫学及分子生物学手段，来解决一系列免疫方面的问题，如抗原表达反应机制、免疫佐剂增强作用、免疫途径择选方法等是以后球虫疫苗研究的发展方向。

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