铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一[1]。由于广谱抗菌药物、激素以及免疫抑制剂的广泛使用，铜绿假单胞菌对多种抗菌药物已经产生耐药性；特别是临床多重耐药铜绿假单胞菌(multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRPA)的出现，使得临床的抗感染治疗变得越来越困难[2]。目前，迫切需要开发新型有效的抗菌药物来解决临床细菌多重耐药问题。

抗菌肽是一类由生物产生的天然免疫复合物，多数具有强碱性、热稳定性和广谱抗菌性的特点，且细菌对其不易产生耐药性[3]，因此其具有成为新一代抗菌药物的潜力。Lycosin-I是一种从穴狼蛛毒液中分离出的富含α-螺旋结构的多肽，隶属于阳离子抗菌肽家族[4]。已有的研究证明lycosin-I对革兰阴性和阳性菌、真菌的多株标准菌株有良好的体外抗菌活性[5]。本研究以临床收集的铜绿假单胞菌为研究对象，探究lycosin-I对临床铜绿假单胞菌菌株的抗菌活性，为临床应用lycosin-I提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 铜绿假单胞菌 随机收集2016年7月至12月期间中南大学湘雅二医院住院患者痰、支气管分泌物、肺泡灌洗液、腹腔引流液、尿液、脑脊液等标本中分离鉴定出的非重复铜绿假单胞菌20株。其中，10株为MDRPA，符合美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐标准：铜绿假单胞菌对下列5类抗菌药(包括头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂复方制剂、喹诺酮类和氨基糖苷类)中3类以上耐药者为多重耐药菌株；另10株为铜绿假单胞菌非耐药株(Non-MDRPA)。刮取菌株至滤纸片，置-20 ℃保存。

1.1.2 抗菌肽lycosin-I 抗菌肽lycosin-I的氨基酸序列为RKGWFKAMKSIAKFIAKEKLKEHL，由湖南师范大学生命科学院制备并赠送[4]。lycosin-I是分离自穴狼蛛(Lycosa singorensis)毒素，后经自主设计、构建和人工合成的一种新型抗菌肽[4]，其纯度经反向高效液相色谱鉴定均在98%以上。

2.3 lycosin-I体外抗铜绿假单胞菌的杀菌动力学 lycosin-I抗铜绿假单胞菌的杀菌动力学曲线见图1。由图1可知，随着lycosin-I作用时间的延长，MDRPA和Non-MDRPA的菌落数逐渐减少。在4×MIC浓度的lycosin-I作用20 min时，MDRPA细菌菌落数减少39.00%，Non-MDRPA细菌菌落数减少30.77%；在40 min时，MDRPA细菌菌落数减少49.29%，Non-MDRPA细菌菌落数减少49.32%。在60 min时，MDRPA细菌菌落数减少47.95%，Non-MDRPA细菌菌落数减少54.29%。

2.4 lycosin-I体外抗铜绿假单胞菌的生长曲线 见图2。由曲线可知，lycosin-I浓度在低于MIC(浓度为0、2、4 μg/mL)时，MDRPA细菌生长基本不受影响，处于对数生长期；而Non-MDRPA在lycosin-I浓度为0、2 μg/mL时细菌生长不受抗菌肽影响，在lycosin-I浓度为4 μg/mL时，虽然0～15 h时细菌生长受到抑制，但在15 h后细菌呈快速生长趋势。而在MIC浓度(8 μg/mL)lycosin-I作用时，MDRPA和Non-MDRPA细菌均不生长。

4)球面波传播系数的线性近似处理方法对波传播演化过程中波形形状的预测精度不高，但相比于传统的局部理想弹性假设方法，本文的近似处理考虑了波传播过程中衰减因子的影响，可以提高粒子速度峰值的预测精度。

1.2.3 杀菌动力学检测[7] 将待测菌(MDRPA的代表株Isolate 8，MIC为8 μg/mL和Non-MDRPA的代表株Isolate 12，MIC为8 μg/mL)重新转种血平板，经再次分纯后，挑取过夜血平板上的菌落接种于LB肉汤培养基中，菌液用比浊仪调整浊度至2麦氏浊度单位(6×108 CFU/mL)。将已配制好的抗菌肽储备液用LB肉汤稀释至4×MIC浓度。用4×MIC浓度的抗菌肽干预细菌，药物50 μL/孔，菌50 μL/孔，先加药物后加菌。将加完样的微孔板置振荡器摇匀，37 ℃温育，分别在不同时间点(0、5、10、20、30 、40、50和60 min时)取10 μL菌液稀释10 000倍。再分别取10 μL稀释后的菌液接种3个LB平板，于37 ℃温育24 h后计数平板上的菌落数，绘制杀菌动力学曲线。

1.1.4 仪器设备 BD PhoenixTM-100全自动微生物鉴定及药敏系统、BD PhoenixSpecTM比浊仪(美国BD公司)；Elx800自动酶标仪(美国Bio-Tek Instruments公司)；MIX-1500微孔板振荡器(上海百典仪器设备有限公司)；Model-5410型恒温培养箱(美国NAPCO公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的鉴定及药敏试验 采用PhoenixTM-100自动微生物分析系统进行菌株的鉴定和临床常规药物的药敏试验。

1.2.2 抗菌肽的体外药敏试验 采用微量肉汤稀释法检测菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，参照CLSI M100-S21[6]文件要求，将待测菌株重新转种血平板、经再次分纯后，挑取过夜血平板上的菌落，接种于无菌生理盐水中，菌液用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浊度单位(1.5×108 CFU/mL)，再用M-H肉汤稀释至约5×104 CFU/mL。将10 240 μg/mL的抗菌肽储备液用M-H肉汤稀释至512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL 共9个浓度。药物50 μL/孔，菌50 μL/孔,先加药物后加菌。设置实验孔和空白对照孔，实验孔加100 μL菌悬液，空白对照孔加100 μL M-H肉汤，每个浓度组设置3个平行对照孔；将加完样的微孔板置振荡器摇匀，37 ℃温育16～20 h，次日用酶联仪测定各孔600 nm处吸光度(A600 nm)值。小孔内完全抑制实验菌生长的最低药物浓度即为MIC。

1.1.3 培养基和试剂 M-H肉汤培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)；LB肉汤培养基和LB琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；哥伦比亚血琼脂平板培养基(江门市凯林贸易有限公司)；氯化钙(CaCl2)和氯化镁(MgCl2)(Sigma公司)。

1.2.4 盐耐受检测 取MDRPA的代表株Isolate 8(MIC为8 μg/mL)和Non-MDRPA的代表株Isolate 12(MIC为8 μg/mL)，分别用M-H肉汤原液及添加5 mmol/L Ca2+(CaCl2盐)或Mg2+(MgCl2盐)的M-H肉汤进行微量肉汤稀释试验，具体操作见1.2.2。通过检测未添加离子及添加Ca2+或Mg2+后96孔板的细菌浊度变化，计算lycosin-I在不同的培养条件下对代表菌株的抑制率，抑制率=(对照组A-实验组A)/(对照组A-空白组A)×100%，并绘制相应的盐耐受曲线。

以上把车轮的运动分解为若干个相对运动，如图4所示：y轴相对惯性坐标系OXYZ做上下平动；坐标系oxyz绕y轴作匀速转动(以上两个运动构成了车轮的刚体运动)；车轮相对坐标系oxyz发生弹性变形。从图4可以看出，与轮轴线垂向振动所对应的牵连加速度在r方向(径向)，y方向(轴向)和θ方向(环向)的分量为

1.3 统计学分析 用SPSS 23.0统计软件进行。对所有数据均进行正态性检验，正态分布变量采用均数±标准差表示；非正态分布的变量采用中位数(四分位数)表示。用成组设计两样本比较的Mann-Whitney U检验比较lycosin-I对铜绿假单胞菌耐药菌和非耐药菌的抗菌活性。以P<0.05为差异有统计学意义。

过程：在几分钟内，大部分同学都拿出了自己的答案，少则一个、多则几个、十几个，紧接着大家开始交流，叫一个学生讲，大家补充。通过交流，同学们不仅找到了问题的答案，而且还找出了规律：这一问题的实质是将几个数分成和相等的两组数，各组数的和应为：1/2（1+2+3+……8）=18

1.2.5 生长曲线的绘制[8] 将待测菌株(MDRPA的代表株Isolate 8和Non-MDRPA的代表株Isolate 12)重新转种血平板,经再次分纯后，挑取过夜血平板上的菌落，接种于无菌生理盐水中，菌液用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浊度单位(1.5×108 CFU/mL)，再用M-H肉汤稀释100倍至约5×104 CFU/mL。将已配制好的浓度为10 240 μg/mL的抗菌肽储备液用M-H肉汤稀释20倍至512 μg/mL，最后以512 μg/mL为最高浓度对倍稀释至8、4、2 μg/mL。参照1.2.2描述进行微量肉汤稀释试验，自加样后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h时用酶联仪检测A600 nm结果，绘制抗菌肽作用后菌株24 h生长曲线。

2 结果

2.1 菌株耐药性 多重耐药菌和非耐药菌对常规抗菌药物的耐药率见表1。

 

表1 20株铜绿假单胞菌的耐药率(%)

  

抗菌药物MDRPA(n=10)Non-MDRPA(n=10)CIP1000SCF800IPM900MEM950TZP1000PIP1000AMK550ATM10020FEP1000GEN1000LVX1000CAZ1000CTX1000TIM955

注：MDRPA,多重耐药铜绿假单胞菌；Non-MDRPA非多重耐药铜绿假单胞菌；CIP，环丙沙星；SCF，头孢哌酮/他唑巴坦；IPM，亚胺培南；MEM，美罗培南；TZP，哌拉西林/他唑巴坦；PIP，哌拉西林； AMK，阿米卡星；ATM，氨曲南；FEP，头孢吡肟；GEN，庆大霉素；LVX，左旋氧氟沙星；CAZ，头孢他啶；CTX，头孢噻肟； TIM，替卡西林/棒酸。

4.3.2 颗粒物浓度监测月变化。从图7～图12颗粒物浓度月变化图可以看出，细颗粒物浓度(PM2.5)呈现峰谷的变化形式，1和12月为高峰，7和8月为低谷；PM10浓度为双峰双谷的形式，5月为第一个峰值，12月为第二个峰值，2月为第一个低谷，8月～9月为第二次低谷。

 

表2 Lycosin-I抗铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(μg/mL)

  

菌株MICRangsMIC50MIC90MDRPA8～64864Non-MDR-PA4～32832

注：MDRPA,多重耐药铜绿假单胞菌；Non-MDRPA非多重耐药铜绿假单胞菌；MIC Rangs，药物最低抑菌浓度范围；MIC50，抑制50%实验菌株生长的最低药物浓度；MIC90，抑制90%实验菌株生长的最低药物浓度。

供水水质对水表计量准确度的影响，体现在两个方面：①水体化学指标含量高，例如pH值在8.0以上，硫酸盐和氯化物的含量在180mg/L以上，会导致管道内部结垢，改变正常的过水流态，继而造成计量偏差[2]。②水体中含有杂质，例如泥沙、丝麻等，随着时间延长，杂质积累数量增多，如果堆积在水孔附近，会减小水孔截面积，因水流速度加快影响计量准确度。

 

注：A，lycosin-I作用于MDRPA；B，lycosin-I作用于Non-MDRPA。

图1 lycosin-I抗铜绿假单胞菌的杀菌动力学曲线

称取适量的抗菌肽粉末，用无菌双蒸水溶解并配制浓度至10 240 μg/mL，经0.22 μm孔径无菌过滤器过滤后置-20 ℃保存，即将使用的储存液亦可4 ℃保存。

2.2 lycosin-I体外抗铜绿假单胞菌活性 lycosin-I抗MDRPA(n=10)的MIC为12(8，32) μg/mL，抗Non-MDRPA(n=10)的MIC为12(8，32) μg/mL，差异无统计学意义(U=42，P=0.579)。见表2。

斯通心里既悲痛也焦急，眼看预定的探察时间所剩不多。5月下旬，肖特拉高原的雨季即将降临。到时候，涓涓细流将会经过山坡，随后汇聚成溪水，迅速冲入洞穴系统，肖特拉洞内的通道将会响彻地下河水咆哮的回声。那时候，休说探险，任何人若不撤出洞穴，都将遭遇灭顶之灾。

 

注：A，lycosin-I作用于MDRPA的生长曲线；B，lycosin-I作用于Non-MDRPA的生长曲线。

图2 lycosin-I作用于铜绿假单胞菌的生长曲线

2.5 lycosin-I的盐耐受性 在体外药敏试验中加入Ca2+或Mg2+后，再观察lycosin-I对铜绿假单胞菌临床分离株的杀菌作用的影响，结果见图3。Ca2+的加入使lycosin-I抗MDRPA和Non-MDRPA的MIC值均升高8倍，即由原来的8 μg/mL升高至64 μg/mL；而Mg2+的加入使lycosin-I抗铜绿假单胞菌的MDRPA和Non-MDRPA的MIC值升高4倍，即由原来的8 μg/mL升高至32 μg/mL。但当lycosin-I处于较高浓度(对MDRPA：>64 μg/mL，或对Non-MDRPA>32 μg/mL)时，仍可保持较好的抗菌活性。

3 讨论

本研究通过应用微量肉汤法检测lycosin-I对临床铜绿假单胞菌的MICs，初步探讨该抗菌肽对于临床铜绿假单胞菌的杀菌活性，结果表明lycosin-I在体外条件下对铜绿假单胞菌有良好的抗菌效果，特别是MDRPA，在较低浓度8 μg/mL时就可以表现出良好的体外抗菌活性。与经典抗菌肽magainin-2和LL-37作用于铜绿假单胞菌的活性结果相比，lycosin-I对铜绿假单胞菌的抗菌活性更好。Dosler等[9]研究发现，magainin-2对铜绿假单胞菌的MIC范围为>128 μg/mL；LL-37对铜绿假单胞菌的MIC范围为32～128 μg/mL。同时，与最近报道的抗菌肽如GL13K[10]、hβD3-CBD[11]、Chensinin-1b[12]、PSN-PC[13]相比，lycosin-I抗铜绿假单胞菌也表现出明显的高杀菌活性。本研究还发现，lycosin-I抗MDRPA和Non-MDRPA的MICs无明显差异，其抗铜绿假单胞菌活性不受其细菌耐药性的影响。抗菌肽对细菌的作用机制主要可以分为胞外途径和胞内途径。抗菌肽胞外作用途径的靶点主要是细菌的细胞膜，即抗菌肽通过其特有的两性分子结构结合于细胞膜后，通过“桶板”“毡毯”“环形孔”“凝聚”等经典模型产生相应的生物学效应，一方面可以减少能量的产生以抑制胞内外的物质交换，另一方面还可以降低穿膜离子电势，两相结合从而破坏细胞膜引起细胞崩解[14]；抗菌肽胞内靶点的作用机制中，更加注重于影响细胞内各种靶标，进而干扰细胞的正常代谢，以达到抑制、杀灭细菌的目的。Tan等[5]在实验中通过荧光标记手段观察到lycosin-I可结合于细菌细胞壁膜，促进染料向胞内流动，因此，推测抗菌肽lycosin-1的抗菌机制可能为胞外途径，即膜透化机制。这种杀菌机制不针对于胞内的某种靶蛋白，全面干扰细菌的正常代谢，推测该机制为lycosin-I抗铜绿假单胞菌不受细菌耐药性影响的原因。

从战略的高度统筹解决水利信息化资源分散的问题。首先，完善“一张表”。制定全市水利统计数据表格，完善现有的水利基础数据库，出台水利数据更新管理办法，确保数源的唯一性和准确性。其次，健全“一张图”。借助现有的GIS技术，做好天地图、google图的数据添加工作，在原有水利普查数据的基础上，进一步整合水利各专题业务的数据信息，实现数据协同与共享。再次，建成“一套规范”。要加强规范建设，落实“统一标准”，从简单到复杂，从核心数据库到外围应用开发，制定 《IP地址分配规定》《水利工程数据库表结构与标识符规范》《水利系统信息交换单位名称代码规范》《水利综合办公业务系统与其他业务系统整合接口规约》等规范。

 

注：A，lycosin-I在M-H肉汤原液及添加5 mmol/L Ca2+或Mg2+的M-H肉汤环境下作用于MDRPA；B，lycosin-I在MH肉汤原液及添加5 mmol/L Ca2+或Mg2+的M-H肉汤环境下作用于Non-MDRPA。

图3 lycosin-I针对铜绿假单胞菌的盐耐受曲线

此前有研究报道lycosin-I对铜绿假单胞菌标准菌株的MIC值约为6.2 μmol/L(即16.93 μg/mL)[5]；并且在抗菌肽的体外药敏试验中发现，虽然由于细菌个体的不同，其对lycosin-I的敏感性存在一定的差异，但大部分菌株MIC值集中在8 μg/mL；此外，国内外大量文献报道抗菌肽的抗菌特性与细菌耐药性无关[15-16]。因此选取MDRPA的代表株Isolate 8和Non-MDRPA的代表株Isolate 12各1株进行抗菌肽lycosin-I杀菌特点的研究。

本研究结果表明，lycosin-I在60 min即可杀灭50%的铜绿假单胞菌；在1×MIC浓度的lycosin-I作用24 h时，相应的微孔中吸光度始终保持在较低水平，两种临床分离菌株均不能生长。这些结果说明lycosin-I的抗菌作用迅速、有效，是该抗菌肽具有较强杀菌特性的表现。

Lycosin-I是一种带正电荷的阳离子抗菌肽，而细菌的细胞膜一般带负电，抗菌肽与细胞膜作用形成二级结构的过程具有一定盐敏感性，即人体内存在的多种带正电荷的盐离子均有可能与lycosin-I竞争结合到细菌的细胞膜，从而减弱抗菌肽本身具有的抗菌效应[17]。本实验探讨lycosin-I的盐耐受情况，在体外微量肉汤稀释药敏实验中分别加入5 mmol/L Ca2+或Mg2+，结果表明Ca2+或Mg2+的加入减弱了lycosin-I的体外抗菌活性，但高浓度的lycosin-I在离子存在的情况下，仍然对多种细菌保持良好的体外抗菌活性。说明lycosin-I在发挥抗菌作用时能够抵御一定程度的带正电荷盐离子的干扰。此外，通过本研究还发现，Ca2+对lycosin-I的抗菌活性的减弱能力强于同等条件下Mg2+的作用。

本研究结果表明lycosin-I对2种铜绿假单胞菌均表现出较强的体外抗菌活性，且杀菌快速彻底，杀菌过程显示出较好的盐耐受性；但本研究仅针对临床铜绿假单胞菌进行观察，研究菌株数还需要增加；同时，该抗菌肽在体外实验中的表现是否与体内实验中一致，将是本研究小组下一步的研究方向。

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