砂梨组织培养及遗传转化研究论文

收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东深圳 518003；3.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)摘要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA （单位下同）+ TDZ ；MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA + TDZ + NAA 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达；适宜的生根培养基为MS + 6-BA + NAA ，生根率达，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号：文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1( of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA ; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA +TDZ + NAA ; using MS + 6-BA + TDZ + NAA asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA +NAA , the rate of rooting could reach , and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1): Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 升汞5min、2%次氯酸钠 + 升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用升汞处理10min 进行外植体消毒。不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，～μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/ 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处理接种数污染数污染率(%) 药害情况升汞10min 30 5 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 20%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞5min 30 10 3%有轻微药害2%次氯酸钠+升汞10min 30 5 7%有药害第1 期王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（）的分化促进作用较高浓度（）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当时, NAA 促分化作用显著优于。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA + NAA 培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 参考[2]3 5 0 0 0 0 参考[3]4 3 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 012 0 0 0 参考[8]13 0 0 0 0 0 1 0 8 0 0 0 5 0 0 表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数生长势17 30 ++18 30 ++19 30 ++20 30 ++21 30 ++22 30 ++23 30 ++24 30 +25 30 ++26 30 +27 30 ++28 30 +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 30 19 +30 0 30 21 ++31 30 20 +++32 30 16 ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA + ZDT + NAA 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA + TDZ NAA 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA + NAA 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. 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植物组织培养及其应用研究概况在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤1．1概念植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。1．2原理植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。1．3试验步骤1．3．1选择和配制培养基培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。1．3．5试管苗驯化移栽试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。2 植物组织培养的应用2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。2．2植物花药培养和单倍体育种将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。2．3植物胚胎培养杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。2．5细胞融合与原生质体培养自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。2．6植物细胞突变体筛选植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。2．7植物体细胞胚胎和人工种子1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。2．9 植物组织培养与转基因技术的应用我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。 3 展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。黑龙江农业科学2006，(3)

植物组织培养研究论文

文章标题：论植物组织培养褐变产生的因素及对策摘要:本文针对植物组织培养中常见的褐变现象,详细地分析了其产生的机理及影响因素,并提出了相应的对策,为科研和生产提供了一定的理论和实践依据。关键词:植物组织培养，褐变，对策目前，在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。1褐变产生的影响因素影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。2褐变产生的机理非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。3防止外植体产生褐变的对策从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。适当外植体的选择取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。对外植体的处理通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。适宜的培养基培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA 时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为)不利于褐变过程的发生[10]。培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。添加褐变抑制剂和吸附剂褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2 结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。进行细胞筛选和多次转移在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。参考文献：[1]徐振彪等.植物组织培养过程中的褐化现象.国外农学——杂粮作物,1997(1):55～56.[2]符近.三种不同类型种子休眠萌发及马占相思种子老化过程的研究.北京农业大学硕士研究生论文,1996.[3]傅作申，玉米耐NaCl幼胚愈伤组织的筛选及特性分析，长春农牧大学硕士论文，1996.[4]颜昌敏编著，植物组织培养手册，上海科学技术出版社,1990.[5]王异星.荔枝细胞培养的初步研究.暨南大学学报,1997,18(5)：84～85.[6]何琼英等.抗坏血酸预处理阻止香蕉吸芽外植体褐变的研究初报.华南农业大学学报,1995,16(3):79～82.[7]张妙霞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究.河南农业大学学报,1999,33(1):87～91.[8]金坚敏.水稻幼穗和成熟种子诱导胚状体时的有关因子探讨.植物学通报，1992,9(2):53～54.[9]金坚敏.水稻幼稿和成熟种子诱导胚状体时的有关因子探讨.植物学通报,1992.[10]王东霞等,如何对抗植物组织中的组织褐变，中国花卉盆景,2002,12:29～30.[11]姚洪军,罗晓芳,田砚亭.植物组织培养外植体褐变的研究进展.北京林业大学学报,1999,21(3):78～83.[12]蔡金星等.不同品种梨多酚氧化酶特性及其抑制剂的研究.河北农业技术师范学院学报,1999,13(1):55～57.[13]陈学森,张艳敏等，植酸在银杏组织培养中应用的研究.天然产物研究与开发,1997,9(2):24～27.[14]刘用生.植物组织培养中活性炭的使用.植物生理学通讯,1994,30(3):214.[15]姚洪军等.植物组织培养外植体褐变的研究进展.北京林业大学学报,1999,21(3):78～84.《论植物组织培养褐变产生的因素及对策》来源于文秘114网，欢迎阅读论植物组织培养褐变产生的因素及对策。－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－植物组织培养植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞，如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。至今，世界各国在无性系繁殖、花卉育种、植株脱病毒和种质保存等方面，广泛应用组织培养技术。（一）组织培养技求的应用 1．无性系繁殖无性系繁殖是植物组织培养应用的主流之一，用植物组织培养进行无性繁殖的优点是，用材少，速度快，不受气候、季节、基质等自然条件的影响，比传统的常规繁殖方法要快得多，人们又叫它'快速繁殖'或'微型繁殖'。其常见繁殖方式有短枝扦插、芽增殖、原球茎、器官分化和胚状体发生。其中芽增殖在盆栽花卉繁殖中应用最为普遍，如草本植物四季秋海棠、鸡冠花、万寿菊、长春花，观叶植物蟆叶秋海棠、网纹草、花叶芋、天鹅绒竹芋，木本植物三角花、比利时杜鹃、月季、八仙花等，在生产实践中，均已取得较好的经济效益。原球茎培养在大花蕙兰、蝴蝶兰、美丽兜兰、石斛、春兰等兰科植物和肾蕨、凤尾蕨、鹿角蕨等观赏蕨的规模性生产中得到广泛应用。胚状体培养，据报道目前已在30个科150种植物上观察到它们的愈伤组织可以分化出胚状体，而盆栽花卉中的花叶芋、山茶花都是成功的范例。器官分化主要是从外植体直接产生不定芽或不定根，一般不通过从愈伤组织进行器官分化形成植株，因为其性状有可能发生变化或经过多次继代培养后，会丧失再生植株的能力。 2．花卉育种当今盆栽花卉育种中，也广泛应用组培技术。胚培养：在花卉种间杂交或远缘杂交中，有时虽然能正常受精，但胚往往发育不完全或胚与胚乳间不亲和，不能得到种子，可采用胚的早期离体培养促使胚正常发育，培养出杂交后代。如山茶花、百合和鸢尾杂交中均采用幼胚培养，成功地收到了杂交种子。同时，在杂交中受精困难，也可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用花粉受精来解决，这在草本花卉花菱草中已取得成功。单倍体育种：利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的时间，还有利于突变中隐性突变的分离。这在花卉的株型、花色、花型的大小或重瓣，叶型、叶色等产生变异，往往有直接利用价值。这在矮牵牛的育种中已应用。体细胞杂交和植物基因工程：利用原生质体遗传操作技术，可以从原来不大可能进行杂交的不同属植物间获得体细胞杂种或核质杂种。可以通过摄取外源目的基因，定向改造植物的某些重要性状。 3．植株脱病毒用无性繁殖方法来繁衍的花卉种类如菊花、香石竹、郁金香、百合、白鹤芋等，不能通过种子途径去除病毒，用化学方法防治和高温处理往往成效不稳定。作为组织培养的无性繁殖材料，最好是去病毒组织，否则易导致病毒积累，危害加重。而植物的茎尖部分无维管束，病毒难以侵入。所以，茎尖培养是获得无病毒植株的最好途径。至今，茎尖培养脱毒法已在菊花、百合、香石竹、郁金香等盆栽花卉上推广使用。 4．种质保存用无性繁殖的植物，因没有种子，只能在植物园内长期栽培保存，耗费大量的土地和劳力。种质材料还易受自然环境的变化和病虫危害而流失。若用组织培养方法，保存愈伤组织、胚状体、茎尖等组织，可节省大量人力和物力。（二）组织培养的几个步骤 1．材料的选用一般用于组织培养的材料称为外植体。常分为两类。一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。另一类主要是根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体，然后形成再生植株。外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量，都对培养时器官的分化有一定影响。一般阶段发育年幼的实生苗比发育年龄老的栽培品种容易分化，顶芽比腋芽容易分化，萌动的芽比休眠芽容易分化。在组织培养中，最常用的外植体是茎尖，通常切块在0．5厘米左右，太小产生愈伤组织的能力差，太大则在培养瓶中占据空间太多。培养脱毒种苗，常用茎尖分生组织部，长度为0．1毫米以下。 2．外植体的消毒植物组培能否取得成功的重要因素之一，就是保证培养物在无菌条件下安全生长。为此，必须抓好外植体的消毒和实行无菌操作。由于培养的植物材料大都采集于田间栽培植株，材料上常附有各种微生物，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋长，造成污染，培养失败。所以培养前必须对外植体进行严格的消毒处理，消毒的尺度为既能全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。目前，常用的消毒剂有次氯酸钙、氯化汞、次氯酸钠、双氧水、酒精（70％）等。具体消毒方法如下：（1）茎尖、茎、叶片的消毒消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将尘埃刷除，茸毛较多的用皂液洗涤，然后再用清水洗去皂液，洗后用吸水纸吸干表面水分，用70％酒精浸数秒钟，取出后及时用10％次氯酸钙饱和上清液浸泡10～20分钟。或用2％～10％次氯酸钠溶液浸泡6～15分钟。消毒后用无菌水冲洗3次，用无菌纱布或无菌纸吸干接种。（2）根、块茎、鳞茎的消毒这类材料大都生长在土中，常带有泥土，挖取时易遭损伤。消毒前必须先用净水清洗干净，在凹凸不平处以及鳞片缝隙处，均用毛笔或软刷将污物清除干净，用吸水纸吸干后，在70％酒精中浸一下，然后用6％～10％次氯酸钠溶液浸5～15分钟，或用0．1％～0．2％氯化汞消毒5～10分钟，最后用无菌水清洗3～4次，用无菌纱布或无菌纸吸干后接种。（3）果实、种子的消毒这类材料有的表皮上具有茸毛或蜡质，消毒前先用70％酒精浸泡几秒钟或2～10分钟，然后用饱和漂白粉上清液消毒10～30分钟或2％次氯酸钠溶液浸10～20分钟，消毒后去除果皮，取出内部组织或种子接种。直接用种子或果实消毒，经消毒后的材料均须用无菌水多次冲洗后接种。（4）花药、花粉的消毒植物的花药外面常被花瓣、花萼包裹着，一般处于无菌状态，只需采用表面消毒即可接种。通常先用70％酒精棉球擦拭花蕾或叶鞘，然后将花蕾剥出，在饱和漂白粉上清液中浸泡10～15分钟，用无菌水冲洗2～3次，吸干后即可接种。 3．组织培养的条件接种后的培养容器置放培养室，室温应控制在23～26℃，每天12～16小时光照，光照度为1000～3000勒克斯。 4．外植体的增殖接种后的外植体要分化出丛状芽、愈伤组织或胚状体，必须对培养基及激素的种类和浓度进行严格的设计和筛选。常用的基本培养基为MS培养基，激素的种类和浓度对外植体的分化和增殖起到重要的作用。也就是说不同的花卉种类对激素的种类和浓度是有差别的（表4－－3）。 5．诱导生根继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，要促使试管苗生根，必须转移到生根培养基上，生根培养基一般应用1／2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根的分化。同时，不同盆栽花卉诱导生根时所需要的生长素的种类和浓度是不同的（表4－4）。一般常用吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）三种。一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。 6．组培苗的移栽生根或形成根原基的试管苗从无菌，温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中，从异养过渡到自养过程，必须经过一个炼苗过程。首先打开试管瓶塞放阳光充足处让其锻炼1～2天，然后取出幼苗用温水将琼脂冲洗掉，移栽到泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等组成的基质中，基质使用前需高温消毒，移栽后要适当遮荫，可用塑料薄膜覆盖，保持较高空气湿度，温度维持在25℃左右，勿使阳光直晒，7～10天后要注意通风和补充浇水，约20～40天，新梢开始生长后，小苗可转入正常管理。

兰花组织培养研究论文

玩家繁殖兰花主要是自然制养护管理注意温度；湿度；通风；浇水这几方面就可以了

细胞工程在高效利用药用植物资源方面有何优势细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。1、粮食与蔬菜生产利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个方面。中国在这一领域已达到世界先进水平，以花药单倍体育种途径，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有30个左右。其中河南省农科院培育的小麦新品种，具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。在常规的杂交育种中，育成一个新品种一般需要8～10年，而用细胞工程技术对杂种的花药进行离体培养，可大大缩短育种周期，一般提前2～3年，而且有利优良性状的筛选。前面已介绍过的微繁殖技术，在农业生产上也有广泛的用途，其技术比较成熟，并已取得较大的经济效益。例如，中国已解决了马铃薯的退化问题，日本麒麟公司已能在1000升容器中大量培养无病毒微型马铃薯块茎作为种薯，实现种薯生产的自动化。通过植物体细胞的遗传变异，筛选各种有经济意义的突变体，为创造种质资源和新品种的选育发挥了作用。现已选育出优质的番茄、抗寒的亚麻、以及水稻、小麦、玉米等新品系。有希望通过这一技术改良作物的品质，使它更适合人类的营养需求。蔬菜是人类膳食中不可缺少的成分，它为人体提供必需的维生素、矿物质等。蔬菜通常以种子、块根、块茎、插扦或分根等传统方式进行繁殖，化费成本低。但是，在引种与繁育、品种的种性提纯与复壮、育种过程的某些中间环节，植物细胞工程技术仍大有作为。例如，从国外引进蔬菜新品种，最初往往只有几粒种子或很少量的块根、块茎等。要进行大规模的种植，必须先大量增殖，这就可应用微繁殖技术，在较短时间内迅速扩大群体。在常规育种过程中，也可应用原生质体或单倍体培养技术，快速繁殖后代，简化制种程序。另外，还可结合植物基因工程技术，改良蔬菜品种。2、园林花卉在果树、林木生产实践中应用细胞工程技术主要是微繁殖和去病毒技术。几乎所有的果树都患有病毒病，而且多是通过营养体繁殖代代相传的。用去病毒试管苗技术，可以有效地防止病毒病的侵害，恢复种性并加速繁殖速度。目前，香蕉、柑橘、山楂、葡萄、桃、梨、荔枝、龙眼、核桃等十余种果树的试管苗去病毒技术，已基本成熟。香蕉去病毒试管苗的微繁殖技术已成为产业化商品化的先例之一。因为香蕉是三倍体植物，必须通过无性繁殖延续后代，传统方法一般采用芽繁殖，感病严重，繁殖率低；而采用去病毒的微繁殖技术不仅改进了品质，亩产量约提高30%～50%，很容易被蕉农接受。近年来，对经济林木组织培养技术的研究也受到很大的重视。采用这一技术可比常规方法提前数年进行大面积种植。特别是有些林木的种子休眠期很长，常规育种十分费时。据不完全统计，现已研究成功的林木植物试管苗已达百余种，如松属、桉树属、杨属中的许多种，还有泡桐、槐树、银杏、茶、棕榈、咖啡、椰子树等。其中桉树、杨树和花旗松等大面积应用于生产，澳大利亚已实现桉树试管苗造林，用幼芽培养每年可繁殖40万株。植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了革命性的变化。1960年，科学家首次利用微繁殖技术将兰花的愈伤组织培养成植株后，很快形成了以组织培养技术为基础的工业化生产体系——兰花工业。现在，世界兰花市场上有150多种产品，其中大部分都是用快速微繁殖技术得到的试管苗。从此，市场供应摆脱了气候、地理和自然灾害等因素的限制。至今，已报道的花卉试管苗有360余种。已投入商业化生产的有几十种。中国对康乃馨、月季、唐昌蒲、菊花、非洲紫罗兰等品种的研究较为成熟，有的也已商品化，并有大量产品销往港澳及东南亚地区。3、临床医学与药物自1975年英国剑桥大学的科学家利用动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，许多人类无能为力的病毒性疾病遇到了克星。用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且诊断异常准确，误诊率大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的单克隆抗体，其灵敏度比当前最佳的抗血清还要高100倍，能检测出抗血清的60%的假阴性。近年来，应用单克隆抗体可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的部位和面积，这为有效的治疗提供方便。单克隆抗体并已成功地应用于临床治疗，主要是针对一些还没有特效药的病毒性疾病，尤其适用于抵抗力差的儿童。人们正在研究“生物导弹”——单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。单克隆抗体可以精确地检测排卵期。新一代免疫避孕药也在研制之中，其基本原理是用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。人类体外受精技术的日趋成熟，使人类对生育活动有了较大的选择余地，促进优生优育，提高人口素质，也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质，抗体等，是生物体内代谢的中间产物或分泌物。过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量低而且很费时。现在，通过培养、诱变等细胞工程或细胞融合途径，不仅大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，可以同时抵御两种以上的病原菌的侵害。用同样的手段，也可培养出能在培养条件下长期生长、分裂并能分泌某种激素的细胞系。1982年美国科学家用诱变和细胞杂交手段，获得了可以持续分泌干扰素的体外培养细胞系，现已走向应用。4、繁育优良品种目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。精液和胚胎的液氮超低温（-196摄氏度）保存技术的综合使用，使优良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展，并且突破了动物交配的季节限制。另外，可以从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子，在体外受精，然后再将人工控制的新型受精卵种植到种质较差的母畜子宫内，繁殖优良新个体。综合利用各项技术，如胚胎分割技术、核移植细胞融合技术、显微操作技术等，在细胞水平改造卵细胞，有可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪等新品种。特别是干细胞的建立，更展现了美好的前景。

A、方法分开的兰丛，不要拆得太零星，每丛至少有3—5苗，最好是一年生植株、二年生植株和三年生植株保留在品种8同一丛中。 (1)垫盆。盆底用—块瓦片盖住排水孔，再用砖块，瓦片或贝壳逐步填充，其中大隙缝填充以泥粒或豆石，一般约为盆内高度的1／2—1／3。上余的净高约10—15厘米，留作培养土层。其具体高度应根据兰花的种类及兰根的长短和盆的高矮而定。铺垫物不要填得太密太实，应保留一点孔隙。实践证明，有的新根能在铺垫层的孔隙中生长良好。 (2)栽植。在铺垫层上，先填上2—3厘米的培养土，用手稍压实，即可将兰花正立摆布其上，根据植株与花盆大小，可以几个单株、2丛、3丛或更多丛种在一个盆里。3丛宜栽成鼎足之势。4丛可栽成四方形，五丛宜列成梅花形。兰根要自然舒展，叶片要四方披拂。要缓缓地将兰根放入盆内，使兰根自然舒展，尽量不与盆内壁碰擦。兰株入盆后，就逐步固定兰株姿势。—盆栽一丛的，应使老假鳞茎偏居一侧，使新芽有发展的余地。一盆栽数丛的，每丛的老假鳞茎应相对地集于盆之中间，使新根新芽向外发展各有足够的空间。 (3)填土。栽植时，一手扶叶，一手添加营养土，执住兰株基部稍往上提，以舒展根系，同时摇动兰盆。让培养土深入根际；继续添土，并摇动兰盆，调整兰株的位置和高度。用手沿盆边按压，但切勿过重而伤根，继续添土并挤压，直至盆面土壤高出盆口2—3厘米，略呈馒头形。培养土应将全都兰根盖住，掩至假鳞茎基部，填土的深浅，传统认为：春兰宜浅，惠兰宜深，但一般以不埋及假鳞茎上的叶基为度。新发兰花在山野里品种9生长时，植株上留下了土表上下的明显标志，可以此标志为准。花盆的大小也要和植株的大小、多少相称，既不要盆大而株小又少，也不宜盆小而株大又多。一般植株的数量，以预计2—3年后刚好长满盆为原则。植株大小与盆的高度相称。既利于生长，又符合观赏要求。 (4)铺面。栽植完毕后，可在盆土表面铺上一层小石粒或青苔，最好是林下优质苔藓，既美观、又可调节水分，还可保护叶面不被泥水污染，新芽也不致感染泥土中病菌而烂心；此外，还可减缓雨水对盆土的冲刷，保持盆土疏松。 (5)浇水。栽植完成后，即浇第一遍水，必须让盆土湿透，水滴宜小，冲力忌大。若置于水盆中浸水、切不可浸泡太久。盆土一经浸湿，立即将兰盆搬出，然后移置于荫蔽之处养护。B、栽培和病虫害 1。试管栽培：随着兰花组织培养技术和无菌播种技术的不断发展，兰花在试管内开花的现象正日益受到重视。这一现象之所以能吸引育种学家的目光，主要原因是原来需要常规栽培许多年才能开花的人工杂交新品种，现在在试管里，通过1~2个培养周期就能人为地促使其开花，这样就可以根据开花的情况有目的地选育具有优良性状的个体，淘汰相对较差的个体，从而使整个育种的周期缩短，并大大减轻大量栽培未见花品种的工作量，使育种工作更富有针对性。由于我们长期从事的是兰属植物中几种常规栽培的地生兰种的开发和研究，因此下面提及的兰花，均是指这几个兰种而言，包括春兰、建兰、春剑、莲瓣、蕙兰、寒兰等。兰花在试管内开花的方式，根据目前的观察结果，大概可以分为三种类型。第一类是由兰苗的腋芽发育成花芽，这种方式跟常规栽培中兰花的开花方式是一样的，只不过常规栽培是一丛苗起花，试管内是单苗起花而已，这种情况在建兰中比较普遍，春兰春剑等品种中比较少见。第二类是兰苗的顶芽发育成花芽，类似通常所说的草中箭（草心箭），花由兰苗最中心长出，这种情况在各个兰种中都有出现，尤其是在春兰中常见。第三类是由原球茎的顶端直接分化出花芽，这类方式完全由培养基内的激素水平控制，起花快而整齐，分化频率高，是目前主要的诱导起花方式。兰花在试管内开出的花朵，基本的品种特征是不会改变的，例如素心品种开素花,绝不会开彩花。凡是有香味的品种,试管内的花也是有香味的,并且香味浓郁,不亚于盆栽兰花的香味,这一点可能出乎很多人的意料。由于试管内的温度等环境条件的原因,花期通常只有几天时间,不如盆栽兰花开花持久，在低温条件下，花期则可以大大延长。兰花在试管内开出畸形花的比例是比较高的，有些品种可以达到10~20%。一般来讲，这些畸形花通常都是生理性的原因和外部培养条件的原因造成的，例如激素水平、无机盐等理化因素，而不是遗传上的相应改变，因此这些畸形花的出现，在遗传和育种上毫无意义。我们曾追踪观察过很多的奇花品系，希望能从中选出新的优良品种，结果绝大多数以后又开出了正常花，真正能稳定的是极少的。一个对兰花培育者十分有用的现象是，试管内开出的花，多数情况下，合蕊柱都能正常发育，具有正常的授粉能力和结实能力，我们曾镜检过小孢子的发育过程，发现其减数分裂过程和花粉粒的形成过程基本是正常的。尤其是以腋芽的方式开出的花，授粉后结出的果实很容易正常发育至种子成熟，并且这些在试管内结出的种子，有一定的发芽能力，尽管发芽率比盆栽兰花的种子的发芽率低，但对育种者来说，已经足够了。随着技术水平的不断进步，人们控制兰花在试管内开花的能力越来越强，这无疑会对兰花的杂交育种工作产生积极而深远的影响。由于兰花的主要欣赏点在花艺上，一个未知的品种，在开花前也基本无法从叶片上判断其优劣，所以育种工作者不仅要选择合适的优良亲本做杂交并且培育出小苗，还不得不把这些小苗，不论好坏，一古脑地种进温室，苦等数年至开花，才能从中筛选优秀单株。这一过程的工作量是很大的。即使获得了优秀的单株，很不幸的是每一个单株的数量也是非常少的，通常只有几苗，根本满足不了市场需求，还必须以这一优秀单株为外植体，再从头做一次组培。从开始作杂交工作，到最后有商品苗供应市场，这一过程要经历两次组培周期，两次从瓶苗到开花的栽培周期，一般要十多年的时间。而试管内开花技术的完善，使我们不必经过栽培过程，就可以在试管内筛选优良株系，并且一旦选出，可以直接进行快繁，不必再经过原球茎的诱导过程，使整个育种周期缩短将近一倍的时间。兰花在试管内开花带来的另一便利之处是使兰花的瓶内杂交成为可能，这是一个全新的应用研究领域。有些育种工作，需要进行反复的杂交，回交和自交，才能实现育种目的，选育出优良的新品种。例如素心品种和梅瓣品种的杂交，子一代通常是梅瓣但肯定不是素心，这就需要子一代和素心亲本回交一次，或者子一代自交一次，再从子二代中选择素心梅瓣。采用常规办法，这一过程肯定要用十几年时间，现在有了促使兰花试管内开花的方法，我们就可以在试管内让子一代开花，并且在试管内进行自交授粉或子一代植株之间相互授粉，并培养出种子。这些种子无需消毒直接播种于培养基上，获得子二代，再诱导出花，即可从子二代中间选择想要的品种了。这一过程比常规方法，至少可以节省两个从瓶苗到开花的栽培周期。另外，由于试管内开花不受季节限制，可以随时诱导，这就为不同季节开花的兰花品种或者是花期不遇的兰花品种之间的杂交提供了很大的便利。换句话来说，试管里开花的兰花，为杂交育种工作提供了稳定的花粉源。依据这一思路，我们在很大程度上摆脱了开花季节的限制和种源数量的限制（有些数量很少的品种，要见一次花可能要等很多年的时间，并且开花时不一定有非常合适的其它亲本材料同时开花），已经成功地实现了不同季节开花的兰花品种之间的杂交。目前而言，兰花这一领域的研究工作，尚处在刚刚起步的阶段，还有很多不尽人意之处，并不是每个品种都能诱导出花，也不是每个品种都能达到需要的成花率，更没有一个现成的程序能让所有的品种开出花来，每一个品种都需要进行大量的试验和摸索。但这些基本都是技术性的问题，相信随着技术的进步，随着更多的有识之士加入到这一领域的研究和开发中来，这些问题会逐步得到解决。 2。繁殖方法：兰花常用分株、播种及组织培养繁殖。 a．分株：在春秋两季均可进行，一般每隔三年分株一次。凡植株生长健壮，假球茎密集的都可分株，分株后每丛至少要保存5个连结在一起的假球茎。分株前要减少灌水，使盆土较于。分株后上盆时，先以碎瓦片覆在盆底孔上，再铺上粗石子，占盆深度1／5至1／4，再放粗粒土及少量细土，然后用富含腐殖质的沙质壤土栽植。栽植深度以将假球茎刚刚埋入土中力度，盆边缘留2厘米沿口，上铺翠云草或细石子，最后浇透水，置阴处10～15天，保持土壤潮湿，逐渐减少浇水，进行正常养护。 b．播种繁殖：兰花种子极细，种子内仅有一个发育不完全的胚，发芽力很低，加之种皮不易吸收水分，用常规方法播种不能萌发，故需要用兰菌或人工培养基来供给养分，才能萌发。播种最好选用尚未开裂的果实，表面用75％的酒精灭菌后，取出种子，用10％次氯酸钠浸泡5～10分钟，取出再用无菌水冲洗3次即可播于盛有培养基的培养瓶内，然后置暗培养室中，温度保持25C左右，萌动后再移至光下即能形成原球茎。从播种到移植，需时半年到一年。组织培养已获成功，有条件的地方可用此法繁殖。 3。繁殖技术 a. 场地选择: 要求四周空旷，通风良好，并靠近水面，空气湿润，无煤烟污染。场地的西南面，可种常绿阔叶树，郁闭度应在0．7左右，这样可减少午后阳光照射，调节湿度与温度。 b．浇水: 以雨水或泉水为宜，不宜用含盐碱的水，如用自来水，应将水搁置数天后使用。浇水要看气温情况而定，春季浇水量宜少，夏季宜多；梅雨季节正值兰花抽生叶芽，盆土宜稍干；秋后天气转凉，浇水量酌减，保持湿润即可。冬季在室内宜干，减少浇水次数，且宜于中午时浇。兰花可淋小雨，但连续下雨或暴雨则易烂心、烂叶，故须注意防雨。蕙兰c．施肥: 栽兰宜用饼肥，以草木灰4份、豆饼10份、骨粉10份混合拌匀，放于缸内，分几次加水，使豆饼浸涨为止，后加盖密封，经一年腐熟，再制成干粒。使用时放于盆面即可。如用全粪，也应经一年腐熟，掺水冲淡滤渣使用。一般从5月开始施肥，至立秋停肥，掌握薄肥多施。施肥应在傍晚进行，第二天清晨再浇1次清水。 d．遮阳及防寒: 除早春及冬季外，都要放在露天棚下。荫棚要求通风良好，兰花在3～4月间刚出房时，可以多晒太阳，以后蔽荫时间渐增。冬季兰花须搬入室内防寒，室温保持1C～2C即可。另外，兰花在春季出房后，秋季进房前，也要注意防霜。 4.病虫害防治 a. 通常使用的方法：兰花的主要病虫害有：（1）白绢病：多发生于梅雨季节。应注意通风透光，盆土排水良好予以预防，发病后可去掉带菌盆土，撒上五氯硝基苯粉剂或石灰即可。（2）炭疽病：终年都有，高温多雨季节更为猖极。防治方法除改善环境条件外，发病期可先用50％甲基托布津可湿性粉剂800～1500倍液喷治，7～10天互次，然后再辅以l％等量式波尔多液，每半月1次。（3）蚧壳虫：在高温多湿、空气流动不畅的情况下，繁殖最快。用常规法防治。综上所述，要养好兰花，必须掌握其自然生长环境条件，采取合理措施，加强养护管理。据《养兰诀》载：“春不出，夏不日，秋不于，冬不湿”，这便是我国养兰经验之概括。 b. 无公害防治病虫害方法：兰花的病虫害，近代多使用化学农药防治。农药使用过量，兰花易遭药害。长期单一使用化学农药或使用次数频繁，会使害虫病菌产生抗药性而起不到防治效果。喷洒农药时还会污染环境，严重者会使人畜中毒。无公害防治兰花病虫害自古有之，近代也屡见不鲜。兰花病虫害无公害防治具有行之有效、成本低廉、取材容易、方法简便、不会污染、无副作用等诸多优点，值得提倡。下面介绍一些民间流传的无公害防治兰花病虫害的小验方。“小”验方，往往也许能够解换“大”问题，兰友们不妨一试。一、茶麸茶麸，也称茶枯、茶籽饼，系茶籽榨油后剩下的渣料，农民常用来洗涤衣服。茶麸中含有皂素和糖苷，其水浸出液里碱性，对害虫有很好的胃毒和触杀作用。防治方法：1．将捣碎成粉状的茶麸、沸水按1：5的比例浸泡一昼夜，用其淋浇兰盆，同时淋浇兰盆放置的场所及其他兰盆，对蜗牛有较好的防治作用。2．用茶麸水喷洒兰株，对蚜虫和红蜘蛛的防治效果很好，可达90％以卜。3．茶麸水还可杀灭蚯蚓。用茶麸水浇透盆土，稍过片刻，蚯蚓便会钻出土表，拣出除之。蚯蚓对兰花的功与过，兰界看法不一。一种看法，认为盆中的蚯蚓，活动时会破坏一些兰菌的菌丝、伤及兰根的根尖，是害虫，必须除之。另一种看法，认为兰盆中的蚯蚓，可吃掉兰盆中许多腐烂物质及兰花的烂根，蚯蚓的活动能起疏松土壤的作用，其粪便还可作为兰花的肥料，功大于过，不必杀之。孰是孰非，有待兰友们根据自己的实践观察，权衡利弊，加以判断。蕙兰二、异味蔬菜（大葱、大蒜、韭菜、生姜、洋葱等）异味蔬菜均有各自的异味，其气味能起杀虫灭菌的作用。防治方法：1．取25克大蒜，捣碎后挤汁，稀释在10升水中，立即喷洒兰株，可治蚜虫、红蜘蛛、介壳虫及灰霉病。将去皮大蒜压成小块，等距离放于兰盆表土，几天后蚯蚓、蚂蚁绝迹。2将切碎的大葱、水按1：30的比例浸泡一昼夜后过滤，用其喷洒兰株，一日喷数次，连续喷洒数天，对防治蚜虫、软体害虫及防治白粉病等均有良好的效果。3．用姜1斤，加水半斤，捣烂取汁，每斤汁液加水6斤，喷洒兰株，可防治蚜虫。4．将韭菜汁、清水按1：60的比例混合，用其喷洒兰株，每日喷2次，重复喷数天，可治愈黑斑病。5．取15克切碎的洋葱鳞茎，放入2市斤水中密封浸泡7小时后过滤，用滤液喷洒兰株，可治红蜘蛛、蚜虫。三、烟头烟叶中含烟碱3％左右。烟碱对害虫具有强烈的触杀和胃毒作用。取20来个吸剩的烟头和一份生石灰，加水搅拌浸泡过滤，再加入30份水，用其喷洒兰株、盆土和盆底，可消灭蚂蚁和其他体无蜡质的害虫。四、洗衣粉和洗涤剂洗衣粉能溶解介壳虫的角膜，同时形成一层泡沫裹住虫体，使介壳虫窒息而死。洗衣粉溶液能防治一些病虫害。防治方法：1．用少量温水溶化洗衣粉，再用水稀释至1000倍液，喷洒兰株，可杀灭蚜虫、粉虱、红蜘蛛。稀释至600倍液，三天喷一次，续喷三次，介壳虫全部死亡。2．将猪苦胆汁、清水按1：100的比例混合，并加入少量洗衣粉，用其喷洒兰株，可防治炭疽病和软腐病。用洗衣粉溶液喷洒兰株，待害虫死后，必须用清水冲洗叶片几次．以使兰株正常生长。五、白酒将白酒、水按1：2的比例混合，喷洒兰株，每周喷一次，续喷三次，可杀灭介壳虫。六、柑桔皮把柑桔皮放于盆底，可防止蚂蚁等害虫进入盆土中为害兰花。还可将柑桔皮切成碎末，撒在盆土表面，几天不浇水，可治蚜虫、介壳虫等。七、红糖将粉状红糖、开水按1：100的比例混合，凉后用红糖液喷洒兰株，每3天喷一次，续三次，对防治霜霉病、白粉病、黑斑病、叶枯病有较好的效果。八、柴油将柴油、水按1：60的比例调成乳剂，再以100倍水稀释后喷洒兰株，可治介壳虫等。九、草木灰将草木灰、水按1：50的比例浸泡两昼夜后过滤，用滤液喷洒兰株，既可治蚜虫，又能增加钾肥。十、食醋将食醋、清水按1：8倍的比例混合，用其均匀地喷洒兰叶正背面，可治介壳虫。如果介壳虫已成虫，可略为提高混合液的酸度，三天喷一次，续三次，就能杀灭己成虫的介壳虫。叶面喷洒食醋液还可消灭黑斑病、白粉病、叶斑病、黄化病等。工业用酸醋忌用。C、注意事项伤口要防菌——换盆或分株时，根部有伤口，要先用杀菌剂涂抹伤口，防止病菌侵入。盆子勿太大——小株栽大盆，植料用量多，容易导致通气不良，浇水也不易控制。若浇水吸水太多，植料不易干燥，细菌侵入引起烂根。兰花要浅植——种植兰株不可太深，否则长期潮湿会腐烂。种植时，将植料填充根部、基部或假球茎必须露出。根部要展开——种植兰花时根部要均匀展开，不可挤压在一起，这样每条根才能接触植料，通气也好。数天不浇水——新种植的兰花，根部可能受伤，伤口涂了杀菌剂，3－5天不浇水，才能达到药效，也能促进新芽新根生长。避免强光照——新种植兰花，都必须避免强光直射，以防脱水，应置于暖和而荫蔽的地方，可以用喷雾来提高空气中的湿度，直到兰花恢复正常生长。

羊草组织培养实验研究论文

什么意思要组培瓶是吗

快速繁殖的研究方法——怎样选取最佳培养方案植物组织培养所阐述的理论内容，在应用到具体植物和每个人所面临的试验条件时，都会遇到一些问题，如怎样协调各个环节，怎样选取一些最佳条件，工作中出现的情况怎样判断是否正常，怎样克服不利影响，怎样诱导培养物朝我们所希望的方向发展等等。下面将介绍一些解决上述问题的方法，即提出问题、设计实验，通过对实验结果的分析，找到答案。许多实验方法在多数情况下要结合自己的工作经验加以灵活运用。在介绍各单项因素选取之前，先对常用的试验方法加以简要说明。（一）、植物组织培养中常用的试验方法1、预备性试验在对某种植物发生兴趣，或对某项因素产生疑惑，或阅读某篇论文后联想到自己的试验中有类似的问题，要初试一下，就可以简单拟定一个方案，比较粗略地判断一下○1该因素是否有影响？○2如果有影响，它大体的程度和数量如何？能用一次较粗略的试验判断出上面两个问题，就基本达到预期目的了。然后便可循着预备试验的路子，设计较为完整的实验方案，已取得准确可靠的试验数据和加深对问题的认识。预备性试验要求比较低，不必深思熟虑，不必很严格，往往灵机一动就做了。植物组织培养条件一旦具备之后，可以做许多工作，做了就摆在那里，观察培养物的反应，有反应的再接着做。通常愈有实验经验的人，愈能判断准确，是预备性试验有较高的命中率，能尽快发现科学研究上的突破口，并由此扩大战果。预备性试验规模较小，条件要求不必面面俱到。在精力允许的情况下多做一点预备性试验，它能加快前进的步伐。预备性试验得出否定的结果也是极有用的信息，它可能预示问题不在这方面，或问题并不简单，这样也会使研究的思考深化。总之预备性试验耗费时间与精力较少，问题直截了当，能使下一阶段的工作更有把握。许多正规的研究往往都要做一些预备性试验，以找准因素及因素水平。2、单因子试验单因子试验中，各项条件和因素都维持在一般水平上，只变动一个因子，以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如MS培养基，其它成分和用量都不变，只变动NAA的用量在0 , , , 之间，以找出NAA用量对某一培养生根的影响。这就是单因子试验。单因子试验，除了要研究的那一个变量以外，其余各方面都应尽量相同或者尽可能相近，实验应安排得很简单。一次变化一个因素，并把全部情况详细记录。通常在进行了预备性试验后，接着再安排一次较全面的单因子试验，就能确定该因子与试验结果之间的相互数量关系。生物学试验不同于物理学或化学实验的地方很多，最重要与最显著的差别是在生物学试验中必要设置对照组与实验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性增加，对照组也可能有一组以上。要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其它培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等等方面，尽可能完全一致（这在组织培养的工作中比较容易做到）。这是因为生物学研究对象的可变因素太多，许多事项难以直观地记录，也不便于将其转换为数字。试验材料来源不纯、不整齐，以后发生了变化，就会说不清是由于试验因子产生的效果，还是因材料之间不同所产生的结果。对照组通常不施加试验因子处理，或维持原先的培养条件。在各组处理项目上，通常要用一定数量的试验材料，因此必须有一定数量重复。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4—10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。这些材料接入的数量和质量都应细心地尽可能保持一致。设置的重复数量越大，试验进行的越仔细，所取得的结果也就越可靠。所得到的试验结果都应经过适当的数学处理，以便能够比较客观地评判试验结果的准确度与可信度。3、多因子试验及正交设计近几年来，由于有了现代统计学等数学方法的帮助，已有可能设计同时试验几个因子的若干个水平的复杂试验了。这样做已表现出了极其显著的优点，即节省时间和精力，同时提供了几个可变因子在交互作用时的效果。例如，采用正交设计，在使用L9表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多个因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此一次系统的试验结果，就可以把问题分析的清清楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。在植物快速繁殖研究中，可用于同时探究培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其它成分的用量。当培养物有切实可靠的指标便于观察计算，即比较容易进行定量化处理的情况下，采用多因子试验都能起到推进试验进程的作用，收到事半功倍的效果。比如出苗数量、苗的高度、生根数量、根长度、移栽成活率等等。在没有上述明确的可计数的指标时，如愈伤组织的生长状况，生长量、分化潜力等，可以根据经验目测，采用评定记分的方法，将状况与质量指标转黄为数字，再进行统计学处理。严格地说，上述指标经过仔细的测定分析，也可以定量化。比如愈伤组织的生长量，可以通过先称取空瓶（带培养基）重，接种后再称取重量，两次重量之差，便是初始接种物的初重量。经过一段时间的培养，先取出培养物（因不便无菌称量，如培养物不保留，则可直接称培养物）转移到已称量好瓶重的新鲜培养基上，再称量瓶重，求出培养物的末重量。初始重量之差，便是培养物的生长量。也可设置对照，称取干重量。可见手续很麻烦。在涉及到分化状况及潜力时，通过制备切片经显微镜观察，也能定出切合实际的数量指标，但上述过程只能用于确有价值的理论研究中。在大多数应用项目中，则嫌其过于繁琐而没有实用价值。凭经验判断打分的办法，误差因素太大，因此，在这种没有具体数字指标试验中，还是以单因子试验比较能说明问题。否则各因子之间的作用交织在一起，常使结果无法解释。4、逐步添加和逐步排除的试验方法在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。（二）主要培养条件及影响因子的选取1、基本培养基的选择在已成功的试管繁殖的植物种类中，以采用MS为基本培养基的为最多。因此，在一般的培养中可先试用，如发现有不利的影响，或不够理想，要想对基本培养基加以改进的话，最好首先降低MS培养基的浓度，其次，可以选择在配料成分上与MS培养基有显著不同的其它培养基加以试用对比，如B5、White、Nitsch培养基等。通常微量元素和铁盐不必配成许多种，只按MS微量元素的配方配成，可用于其它培养基成分中。混合的微量元素一般配成的浓度是每升培养基中加入1ml或5ml。在取得稳定的分化增殖时，微量元素可以减少甚至省略。配方中微量元素用量也有很大差异，如ER培养基中的用量，就只有MS配方中的1/10。培养基中的有机成分变化最大，不必拘泥于某一配方的要求。在遇到难以分化的材料时，常常是增加培养基的复杂性，不断加添可能有希望的营养成分或者生理学上的活性物质，在培养成功后再逐步减去。因此可能发现，一些成分在推进试验结果方面，其实是些无关的因素。但是其中有些是起了推进作用的。在试验没有成功时，加入总比不加入好，多数有机成分的用量都不宜过高，如生物素常用—。某些有机物是植物组织生长分化的必需物质，是代谢环节中的电子传递体，在整体植物中它们可以自行合成，离体组织则合成减少或不能合成，或因伤口面积剧增、代谢消耗加强而供应不足，因此，即使加入很少，有和没有是不一样的。基本培养基选取的实例：把月季丛生苗分别接种到MS、B5和White三种培养基上，这三种培养基除基本的无机盐配方以外，其它成分都完全相同。培养1个月以后，可以看到一点变化，第二个月，转接一次继续培养，第三个月再转接一次。这样，大约在第三个月末或第四个月初，即可看到这三种培养基对月季幼苗生长与增值的影响。其中以MS培养基最好，苗生长快，增值倍数高；B5培养基较差；而White培养基最差，幼苗生长慢，增值倍数低。试验结果如以MS为100%，B5约为86%，White约为73%。这样就可以选择MS培养基为基本条件，用于月季的试管繁殖。在这个例子中，三种培养基互为对照组，或认定MS处理的为对照组。2、植物激素配比的选择从植物组织培养文献中所累积的资料看，要使植物组织分化出苗和使苗能快速增值，选择植物激素的种类和调节细胞分裂素与生长素的用量是最重要的一环。形象化地说：这是最灵敏的一个旋钮。在选定或者暂时认定某一基本培养基后，或者同时，通常首先要考虑的都是植物激素的配比。例如，采用MS培养基，细胞分裂素用BA，生长素用NAA，用量：BA暂定为2mg/1，NAA暂定为或者,这样的培养基现在通用的写法为：MS+BA2+—。培养温度为24—26℃,每天光照10小时。这种培养基和条件已使比较容易再生的上百种植物顺利分化和增值，初试不妨先试一试。培养一段时间以后，可以根据大多数培养物及其中少数组织块的表现，来修订下次培养基中植物激素的用量。这一过程，也就是收集培养物对培养基及培养条件的“意见”。培养物的各种表现说明什么问题，以及应当如何调整，后面要做详细介绍。预备试验也可以一种以上，如除上面一种以外，可扩展为：MS+BA1+，MS+BA3+等，如培养物反应不理想，可以查阅、参考近似科、属和属内其它种的培养条件。选取不同激素用量也可以用两组单因子试验来进行：第一组找出适宜的BA用量，第二组找出适宜的NAA用量。第一组 1—1 MS+BA1+ 1—2 MS+BA2+ 1—3 MS+BA4+在这组试验中NAA的用量不变，注意观察BA对培养物的影响。第二组 2－1 MS+BA2+ 2－2 MS+BA2+ 2－3 MS+BA2+在这组试验中BA的用量不变，注意观察NAA对培养物的影响。象这样比较简单的试验，就用不着BA和NAA两个因子都同时变。从试验结果中可以选出较优的一两种处理，或可预示在上两组试验中未曾出现的组合，需要调整后再继续试验。比如上述试验中1-2较好，2-3较好，重新试验时，就可以选MS+BA2+的激素配比。也可以计量级变化更大的试验，作预选，形象地说进行筛选的“筛眼”更粗大些，探测范围更宽些。如BA选定1、3、5mg/1；NAA选定为、、5mg/1;或者、、、等等。在这组试验结果明朗以后，比较优组合为出发呆呢再设计新的组合，并将量级划小，两三轮试验后，定可找到最佳的激素组合。对于许多植物来说，这样的试验已足够了。特殊情况下，如解决不了问题，就可进一步选用KT、ZT、2-ip等其它细胞分裂素，以及IAA、IBA、2,4-D等其它生长素，并试用正交试验法、优选法等安排多因子的试验。以细致耐心的多次试验，逐步缩小包围圈，最后找到适宜的细胞分裂素、生长素的种类与用量，使该种植物能顺利地高速繁殖。应当记住，所有试验应在相同的培养基上重复继代2-3次，以确证其效果。如果把少量试验材料在颇大差异的培养基上转来转去，弄得试验结果无法分析，是不能提供真实数据的。最妥善的办法是加大工作量，重新开始，消毒和接种更多的试材，并仔细试验与观察。3、糖浓度的选取采用单因子试验，或结合植物激素的选取，采用正交试验来确定最佳糖浓度。通常选择的幅度很小。对大多数植物来说，适宜的浓度为20或30g/1,个别情况用到40g/1.在花药培养时变化幅度较大，有时用到70—150g/1。4、 PH值的选取一般植物对PH值的要求不很严格，如山茶、杜鹃和叶子花等，可以适当降低PH值到或。试用于新培养的种类时，可参考过去已发表的类似植物。采用只变动PH值的单因子试验，可以迅速了解到适宜的PH值。第一次可试用、、及，等第一次结果出来后，再细调一次，即可确定出最佳PH值。在培养过程中，培养基的PH值会随养分消耗而变动，因此量级差别太小时，试验结果的差异也不明显，只要培养物的生长增值能满足快速繁殖的要求，就不必过于精心。5、温度和光照在没有专门的设备条件下，温度和光照要求的选取也不必过细。利用培养架的顶部、中部、下部，分别放置培养瓶和温度计，经过一段时间的培养，即可比较出该植物需要的温度范围。对光强的需要，可通过植物距离光源的远近不同来比较得出。没有特殊的需要，一般不做光周期的研究，打多数专家认为10-14小时光照时必需的。有条件的单位可以购置光照培养箱。这种设备可以准确地控制每天光照的时间，即可任意控制光照和黑暗的周期性变化，光强度可通过灯盏的数目给予调节。设有升温和降温装置，能调到任意，变化范围在+1℃左右。光照培养箱对于研究培养物的春化处理和光周期对植物发育的影响是较理想的。箱内的湿度只能作大体上的调节，但这一点关系并不很重要，因为培养瓶中的湿度一般都是打到100%的。如果妥为利用，在这样的试验条件下，能够影响植物生长发育的几个最重要的因素，都已在人为地控制下了。这是目前在微型整体水平、组织或器官水平、细胞水平上能比较精密控制的较理想的设备。用这种光照培养箱当然可以方便迅速地找出某种植物快速繁殖所要求的最佳温度和最佳光照条件。6、综合因子的最终确定在各个单项因子的最佳条件找到以后，将这些最佳条件综合到一起，进行全面实验，并根据实验结果，再做适当调整，试验工作就可结束，将研究成果扩大，应用到大规模的快速繁殖中去。

组织培养论文答辩ppt

首先是准备一份PPT。

PPT最好是自己亲手制作的，自己亲手制作的PPT，比较清楚讲解的内容都有哪些。

PPT不用很精美，不要强求像商业PPT那样充满着酷炫和动画。但也要有所修饰，显示出自己是认真对待的。一个小技巧：参考某个老师上课PPT的风格;

相对于现场答辩，远程视频答辩时评委们会对您的PPT内容多些关注，所以要重视;

PPT页数不要很多，大约18~20页左右就行;

字体建议用微软雅黑、大小设在20比较好，标题设在24(如有标题的话);

背景颜色不要与图表和文字的颜色相混，建议背景采用白色为主;

学校的LOGO最好用透明的，在首页可以放在正中，其它页放在右上方;

PPT上的内容以提纲和图表为主，不要有大量的文字;

PPT的内容以要解决的问题、问题的分析过程和问题的解决方法及结果为主。

1)PPT首页要醒目、简洁，内容包括：论文标题、学校LOGO、导师姓名、答辩人姓名、专业名称和日期;

2)选题意义：用简短的话介绍一下现实问题和对企业、社会的意义，如果个人的管理背景对评审员会产生好印象的话，也可以顺带提一下;

3)论文架构：可以是思路框架或者目录，用一页显示出来;

4)文献综述、公司背景介绍要简洁一些。尤其是管理概念和国内外研究，评审员并不感兴趣(除非涉及到行业的专有名词可稍作介绍)，这一块不要花太多时间，否则会遇到有些评委催促您尽快进入正题，影响了自己的情绪和答辩的氛围;

5)不要强调创新，创不创新专家们比咱们懂。越强调创新越显示出您看的文献太少;

6)论文要点：存在的问题、分析过程、解决方案和保障措施，尽量用图表来说话;

7)结论部分：强调一下与问题的对应性。

整个PPT要讲解的内容要与学校要求的时间相接近，最好自己写一份详细的讲解内容。试着在家里练习一下，看时间如何控制;

如果是远程视频答辩，要保证环境安静和网络通畅。

其次，准备好一份纸质的论文和笔，以便在评委提出问题和修改意见时可以随时翻阅，并能在需标注的地方进行记录。要及时记下这些问题，要不然您后面就想不起来当时提的什么问题，从而导致不能有针对性地修改。

进入现场

上台时建议向评委老师们行个礼。如果是远程视频答辩，要主动与老师们打招呼。行礼的好处不仅是对他们的尊重，更主要的是行礼可以让您镇静一下情绪，由被动转为主动;

讲话时口齿要清晰。要像向您的客户推荐您的产品那样自信、清楚地传达您的声音;

要控制好节奏，不要太快;

不要读PPT，尽量面向评审员。记不住的地方，可以看看自己的讲稿;

在答辩过程中，要以听和记录为主，对于有分歧的地方，尤其是感到“危机”(可能要通不过)的时候，也要以尊重评委为先，然后再解释自己是如何考虑的(尽量做到自信、心中有数)。因为很多管理问题是没有标准答案的，态度好坏却是在每人心中都有一把尺的;

答辩完成后要感谢评审老师们的辛勤付出(毕竟他们是来给您把关的)。

最后，无论答辩情况如何，也要坦然面对，该修改的地方要进行修改。

论文答辩也是课程学习的一部分，是在毕业前上的最后一堂课。在这里可以比较综合地总结自己所学到的知识，并且锻炼了自己的表达能力和演讲能力，同时也可以从评审老师那里面对面得到知识。好好把握，祝愿各位答辩顺利通过!

模板背景千万不要太花哨因为是学术论文字数尽可能少一些，自己准备演讲稿展开PPT不是最主要的弄熟论文才是王道模板题目答辩人指导老师论文结构（目录）是否有创新之处论文研究目的方法过程挑重点说出本论文的闪光点（切忌不要放太多，要熟悉内容，否则......）结论感谢可行性研究类文章最好字数少一些配合图表以及具体实例。最最重要的是熟悉论文这是最根本的。还有一点是PPT是论文的缩影，重点突出自己会的，到时候就会的多讲点，要是有演示程序什么的就弄到最后边，讲完PPT就跑跑程序。答辩的老师不会细看所有论文的，主要就是听你的PPT，所以一定要扬长避短，还有，最好要突出你论文较新的东西，就算是讲和别人相似的题目有相同的地方也绝不说自己和谁的比较像，最后就是只要是你写在PPT上的就一定弄懂了，PPT前边的会比后边的更受答辩老师关注。我刚参加完答辩以上是我的建议

答辩PPT怎么做？？

首先是封面页

要点：

1、论文题目清晰明了，字号最好最大，能够一目了然。

2、需要标注好答辩人和导师姓名。

3、适当添加学校元素，丰富画面。

其次，目录页需要清晰明了，一般需要包括课题背景、课题现状、研究过程、研究结果和解决方法和致谢内容，可根据自身论文情况做调整。

再次，每个部分的内容需要简洁明了，能够一语中的，最好是能够列要点，而不应有太多冗长的大片文字。在讲解研究思路时可以适当地添加逻辑线，图文并茂。在展示实验结果，也需要表格、重要数据的展示辅之以必要的文字说明。

最后，尾页要致谢，感谢导师们的聆听。