显微镜发展历程小论文参考文献
人类的第三只眼
——1931年电子显微镜的发明
1931年，德国科学家恩斯特·鲁斯卡与组长马克斯·克诺尔博士制成了世人公认的第一台电子显微镜。1932年，恩斯特·鲁斯卡发表了以“几何电子光学的进展”为题的论文，第一次使用电子显微镜的名称，所以这一年被认为是电子显微镜的发明年份。
除了动植物以外，自然界还有一个庞大的生物世界，就是微生物。它们都很小，小到把几亿个微生物堆积在一起时，也只有一粒米那么大小。显微镜的发明打开了人类通向微生物等微观世界的大门。1590年，杨斯岑兄弟发明了世界上最早的显微镜。17世纪中期人类发明了光学显微镜，18世纪荷兰人列文·虎克借助显微镜发现了组成动植物身体的细胞，逐步认识了细胞核及其作用，这是显微镜发展史上的第一个里程碑。
随着对细胞的不断深入研究，光学显微镜的局限性日益明显。由于它以可见光作为光源，分辨能力受到光波影响，无法进一步了解细胞的微细结构。人们期待分辨本领更高、功能更强的超级显微镜。
1931年，生于德国海德尔堡的工程师恩斯特·鲁斯卡在其组长马克斯·克诺尔博士指导下对显微镜进行了自16世纪荷兰人加装第二块透镜以来最重要的革新：他们研制出了一台电子显微镜。这台显微镜能将物体放大十几倍。1932年，恩斯特·鲁斯卡致力于提高电子显微镜的分辨本领，在德国《物理学进展》杂志上发表了以“几何电子光学的进展”为题的论文，第一次使用电子显微镜的名称。此后，电子显微镜成了20世纪后期科学家对微观物质结构和生命形式进行探索的强有力的工具。
有两次“发现”为克诺尔和鲁斯卡的研究奠定了基础。1924年，法国物理学家路易·德布罗意发现电子束呈波状运动，但其波长要比光的波长短得多。德布罗意的发现意味着如果能找到使电子束聚集的方法，就能将其用来放大物像。两年后，德国物理学家汉斯·布施发现了调节焦点所产生的效果：电磁场或静电场中不再有电子了。实际上，电磁场或静电场成了一个透镜，电子变成了光。结合两者，电子显微镜被发明并以惊人的速度发展。
20世纪30年代末，德国西门子公司、英国的大都会·维克尔公司和美国无线电公司等这样的著名高科技公司，完善了电子透镜的基本原理，将电子束聚集在真空腔内形成的电磁场或静电场中，从而达到放大物体的目的。1938年，可将照片放大3万倍的电子显微镜研制成功。
此后，出现了一种改进型的电子显微镜，这种显微镜可将物体放大10万倍。伴随着技术和设备的不断改进和提高，人们终于实现了观察原子的理想。光学显微镜的最高分辨本领约为200纳米，与此相对应的最高有效放大倍数是1500倍。现代高分辨电子显微镜的分辨本领已达纳米、放大倍数在150万倍以上，这相当于把一个直径4米的气球放大到地球那么大。它还可以把原子放大成一个个小馒头那么大，那么清晰可见。
这里，要提一句的是，从19世纪末到20世纪20年代，尽管已有不少杰出的科学家发现了电子束可以聚焦并得到了成像公式，但为什么没有引导他们让电子束代替光束发明电子显微镜呢?主要原因之一是他们远离科学实验。而鲁斯卡敢于排除人们的偏见和责难，勇于实践，终于发明了电子显微镜。
自电子显微镜发明到商用开始，全球电子显微镜市场在高校、科研院所、工业等方方面面科研需求推动下快速发展，如今已经形成了稳定的行业格局和稳步增长的市场规模。并且未来，随着不断增长的研发活动，以及大国科技竞争等国际背景加持下，电子显微镜进行科学研究需求还将不断增加。
全球电子显微镜行业相关公司：赛默飞、日本电子、日立高新、蔡司、捷克TESCAN、韩国COXEM、中科科仪等
本文核心数据：全球电子显微镜行业市场规模、全球电子显微镜行业细分市场规模等
全球电子显微镜行业发展历程
电子显微镜，简称电镜，经过五十多年的发展已成为现代科学技术中不可缺少的重要工具。
回顾发展历程，首先在1926年，德国物理学家汉斯布什研制出了世界上第一个磁力电子透镜。紧接着，1932年，德国物理学家鲁斯卡根据电子光学原理，用电子束与电子透镜代替光束与光学透镜，制作出世界上第一台透射式电子显微镜。随后，1939年西门子公司实现了电子显微镜的首次商用，这也形成了现代电子显微镜市场的雏形。
电子显微镜的诞生，使人类的微观视野达到了原子精度的水平。到21世纪，电子显微镜已广泛应用到生物学、医学、材料科学、地质勘探、灾害鉴定以及工业生产等领域，拥有较大的市场规模。
外企为全球行业主要参与者
从行业参与者情况来看，由于技术水平较高、资金/人才投入大等因素影响，全球电子显微镜参与企业较少。目前，全球电镜市场企业格局基本稳定，形成了赛默飞(含FEI)、日本电子、日立高新、蔡司、TESCAN、COXEM等几大电镜巨头。
市场规模逐年增长
在全球电子显微镜市场方面，根据日本电子年报公布的数据显示，近年来随着全球对生命科学、材料研究的探索和研究持续深入，以及对半导体需求不断扩大等，推动了高校、科研院所、半导体工业等领域对电子显微镜的需求。全球电子显微镜行业市场规模呈不断增长趋势。
2016年全球电子显微镜行业市场规模为亿美元，至2019年涨至亿美元。2020年受全球安全卫生事件影响，全球电子显微镜行业规模保持了持续增长趋势，但增速有所放缓，约为亿美元，较2019年增长。
扫描电镜是主要细分市场
从电子显微镜细分产品规模来看，当前电子显微镜的需求主要以扫描电子显微镜为主，占比电镜市场规模的74%左右，2020年约为亿美元;而透射电镜则由于技术水平和价格高、操作难度大，分辨率可达原子级别，主要对样品晶体结构进行分析等，应用市场还尚未完全打开和释放，故总体规模还较小，2020年约为亿美元，占全球电镜的26%左右。
不断增加的研发活动带动市场需求
由于高倍率，电子显微镜在生物学、材料科学、纳米技术和半导体工业中具有重要的应用。不断增长的研发活动，以及较易获得国家、政府科研资金等，将推动生命科学和材料学等领域利用扫描电子显微镜进行科学研究需求增加，从而推动电子显微镜的增长。
根据日本电子预测，未来全球电子显微镜将保持的复合增速保持快速增长，到2026年全球电子显微行业市场规模将超过38亿美元。
更多行业相关数据请参考前瞻产业研究院《中国电子显微镜(电镜)行业 市场前瞻与投资规划分析报告》。
【历史沿革】
1926年汉斯·布什研制了第一个磁力电子透镜。1931年厄恩斯特·卢斯卡和马克斯·克诺尔研制了第一台透视电子显微镜。展示这台显微镜时使用的还不是透视的样本，而是一个金属格。1986年卢斯卡为此获得诺贝尔物理学奖。1938年他在西门子公司研制了第一台商业电子显微镜。
1934年锇酸被提议用来加强图像的对比度。1937年第一台扫描透射电子显微镜推出。
一开始研制电子显微镜最主要的目的是显示在光学显微镜中无法分辨的病原体如病毒等。1949年可投射的金属薄片出现后材料学对电子显微镜的兴趣大增。
1960年代投射电子显微镜的加速电压越来越高来透视越来越厚的物质。这个时期电子显微镜达到了可以分辨原子的能力。
1980年代人们能够使用扫描电子显微镜观察湿样本。1990年代中电脑越来越多地用来分析电子显微镜的图像，同时使用电脑也可以控制越来越复杂的透镜系统，同时电子显微镜的操作越来越简单。
【简介】
电子显微镜由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。
镜筒主要有电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体。
电子透镜用来聚焦电子，是电子显微镜镜筒中最重要的部件。一般使用的是磁透镜，有时也有使用静电透镜的。它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦，其作用与光学显微镜中的光学透镜（凸透镜）使光束聚焦的作用是一样的，所以称为电子透镜。光学透镜的焦点是固定的，而电子透镜的焦点可以被调节，因此电子显微镜不象光学显微镜那样有可以移动的透镜系统。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子源是一个释放自由电子的阴极，栅极，一个环状加速电子的阳极构成的。阴极和阳极之间的电压差必须非常高，一般在数千伏到3百万伏特之间。它能发射并形成速度均匀的电子束，所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。
样品可以稳定地放在样品架上，此外往往还有可以用来改变样品（如移动、转动、加热、降温、拉长等）的装置。
探测器用来收集电子的信号或次级信号。
真空装置用以保障显微镜内的真空状态，这样电子在其路径上不会被吸收或偏向，由机械真空泵、扩散泵和真空阀门等构成，并通过抽气管道与镜筒相联接。
电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。
显微镜论文参考文献要求
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标题应该在标题之后。在每张构图的右下角，应标明每张构图的序号。显微镜病理图像应显示染色方法和放大倍数，染色方法和放大倍数之间，手掌之间有一个字间距。
扩展资料：
论文写作要求：
1、头衔，应能概括整篇论文最重要的内容，简洁、醒目，一般不超过20字，论文摘要及关键词。
2，论文摘要应阐述论文的主要观点，说明本文的研究目的、研究方法、研究结果和结论。尽量保留原稿的基本信息，突出原稿的创新成果和新思路。它不应该是一个简单的章节标题列表。用500字左右比较合适。关键词是反映论文主题的最重要的词语和句子，一般为3－5个。
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5、正文，它是毕业论文的主体。
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高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. 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小哥白尼杂志显微镜
科学实验是一种以认识自然为首要目的的实践活动。它作为认识自然的研究方法, 在很多方面优于一般的观察和生产实践活动。虽然在古代就已经出现了科学实验的萌芽和雏形, 但始终没有成为科学家们普遍应用的科学方法。伴随着自然科学同宗教神学、经院哲学的激烈斗争, 一批哲学家、科学家极力提倡科学实验, 并把科学实验作为科学战胜对手、壮大自己力量的有力武器。由于科学实验日益成为独立的社会实践方式, 不仅使近代自然知识有了特有的实践基础, 也促进了科学形态的变化, 出现了与古代实用科学、自然哲学不同的崭新的科学形态, 即实验科学。近代自然科学是建立在科学实验基础之上的实验科学。 早在 13 世纪时, 罗吉尔·培根就曾提倡科学实验, 由于时代的限制没有产生多大影响。达·芬奇在反对教会和经院哲学的斗争中,主张向大自然请教, 提倡实验方法, 认为科学如果不是从实验中产生并以一种清晰实验结束, 便是毫无用处的, 充满荒谬的, 因为只有实验才是确实性之母。达·芬奇被称之为近代实验科学的开路先锋。近代实验科学的奠基人和主要代表则是伽利略, 他生在意大利的比萨, 父亲是个酷爱音乐和教学的贫困的贵族。父亲的爱好和性格都在儿子身上重现。伽利略开始学的是医学, 由于爱好数学, 转而学习数学和物理学。通过对物理现象的独立研究, 他发现了被奉为权威的亚里士多德的许多严重错误。尽管因此而遭到非议, 但他认为只要自己的观点同经验和理性相符合便是正确的, 至于是否和旁人观点一致则毫不在乎。他一生不仅宣传哥白尼的天文学说, 而且发展了日心说。他利用合成的镜片, 制成了天文望远镜, 通过观测到的新事实, 批驳了经院哲学的教条。经院哲学认为, 球状天体是绝对完备的, 太阳毫无瑕疵, 宇宙间只能有一个环绕中心。伽利略却用观测事实宣布, 太阳有黑子, 月球表面有山谷, 木星有四个卫星, 犹如一个小太阳系。伽利略因用新的发现支持了哥白尼的学说, 被教会当做异端分子, 遭到了经院哲学的攻击, 说他触犯了亚里士多德的权威。1615 年, 罗马教会传讯伽利略, 教皇保罗五世警告他不得“持有、传授或捍卫”哥白尼的理论。但是伽利略并没有放弃自己的观点, 他于 1632 年发表了轰动整个学术界的 《关于两大世界体系(托勒密的和哥白尼的)的对话》 一书。这部著作被称之为近代天文学的三部最伟大的杰作之一(另两部是哥白尼的 《天体运行论》 和牛顿的 《自然哲学的数学原理》)。1633 年伽利略因发表 《对话》 再次受到罗马教会的传讯, 遭到刑讯逼供。伽利略被迫宣布放弃信仰, 但仍被判处监禁。虽然如此, 他对科学的热忱仍不减当年。在被监禁和半监禁的情况下, 在他一生的最后 9 年中,他一直进行着艰苦的科学研究工作, 完成了 《关于两种新科学(力学和运动的位置)的谈话与数学证明》 一书。这部书被秘密偷运到荷兰于 1638 年出版。伽利略对天文学的贡献固然重要, 从对科学的发展看, 他对力学的贡献更为重要。由于伽利略的工作, 创立了动力学, 即关于运动物体的科学。亚里士多德认为物体下落的速度正比于物体的重量, 所以重物体要比轻物体降落得快。1586 年, 斯台文曾作过一次实验, 把两只重量不同的铅球从 30 英尺的高度同时落下, 发现它们几乎同时落到木板上, 重物体并不比轻物体下落得更快。据说, 伽利略也曾在比萨斜塔上作过类似的实验。究竟伽利略是否作过这个实验, 科学技术史界至今仍有不同看法。其实伽利略的重要贡献并不在于作过一次实验, 而是在于他作了一系列巧妙的落体实验, 对实验作出了理论分析, 并用数学方法对实验结果定量地加以表示出来, 由此否定了亚里士多德的错误结论, 建立了自由落体运动的定量规律。为了弄清落体运动的过程和原因, 伽利略首先引入匀加速度的概念, 以区别于亚里士多德的匀速度。亚里士多德认为, 力是产生运动(速度)的原因; 伽利略通过实验及理论分析表明, 力是产生加速度的原因, 力所引起的“不是物体的运动, 而是运动的改变”。自由落体的速度与落体重量无关, 但却随时间的增加而增加。其定量关系是: 降落速度 V 与时间 t 成正比, 降落距离 S 与时间 t的平方成正比。这就是自由落体定律。伽利略通过斜面实验和摆的实验检验了上述的结论。由于自由落体运动得太快, 不能直接测量它通过的距离和所用的时间。伽利略便设计和制造了一个光滑的斜面和平面, 让黄铜小球沿斜面下滑到不同的预定距离, 再对其所用时间加以比较, 证明了所经距离之比与时间平方之比相等。通过斜面实验还发现了一些新的重要事实: 小球的末速度与斜面的倾角无关, 仅随垂直高度而变化; 获得一定的末速度的小球, 当进入到一个平面之后, 如果没有外力的作用, 且平面足够长, 它就将按原有速度作匀速直线运动, 一直运动下去。由此又引出来一个重要的力学原理, 即物体在不受外力作用的条件下, 其运动速度将保持不变。这就是惯性定律。在这之前,自亚里士多德以来, 人们却一直认为, 物体只有在不断受到力的作用时才能运动。惯性定律则彻底否定了这个错误的结论, 这也证明了力是产生加速度的原因。为了消除空气阻力对实验中的运动物体的影响, 消除运动物体和斜面接触时所产生的阻力(即摩擦力) , 伽利略又进行了单摆实验, 证明了媒质的阻力在摆的振动中没起多大作用, 同时证明了相同的摆摆动一次所花时间相同, 与摆的振幅大小无关。摆振动的同时性的发现, 使伽利略想到有可能制造摆钟。他曾指示他的儿子和学生动手研制单摆钟。在成功地把摆的振动和落体运动相类比之后, 伽利略又对抛射体的运动进行研究。按亚里士多德的冲力理论, 一个抛射体因获得冲力而直线上升, 然后当冲力耗尽之后, 再在引力作用下垂直下降。伽利略则证明了一个沿平面运动的物体, 当运动到平面的尽头时, 一方面按惯性原理则该物体应按同一方向匀速运动; 另一方面该物体因失去支撑, 按自由落体定律应垂直下落。这两组运动组合起来, 便使该物体的运动路径形成一个半抛物线。当把一个物体沿倾斜面上抛时, 它的路径则恰好是一条抛物线。这可以用力的平行四边形法则求出来。因此, 牛顿把伽利略说成是力的平行四边形法则的发现者。伽利略作为近代实验科学的奠基人, 不仅以自己的实验成果启示人们如何去进行自然研究, 而且告诫人们必须用实验去获得物理学的基本原理和考核推理的结果, 而不能盲目相信书本。特别是伽利略还把实验的观测同数学的演绎结合起来, 而不是单纯依靠经验。伽利略的实验方法、数学方法和分析方法, 深刻地影响了与他同代和在他以后的科学家们, 成为以后科学研究的基本方法。在伽利略的时代, 还有一些科学家们积极提倡实验方法。英国的吉尔伯特(公元 1540—1605)就是其中之一。他赞赏工匠的经验技能, 反对盲目信仰权威。吉尔伯特对磁学进行了多方面的实验研究, 并把他写成的书“献给那些在实践中寻求知识的人”。由于吉尔伯特是个御医, 他曾在女皇伊丽莎白面前作过磁石实验, 因而吉尔伯特的实验活动和尊重科学实验的思想, 在当时也有较大的社会影响。 科学实验活动的兴起, 近代科学方法的建立, 还有赖于哲学的引导。在科学从中古时代向近代转变的关头, 有两位杰出的哲学家积极倡导近代科学方法, 并对推动科学的发展有重要作用。一个是英国的弗兰西斯·培根(公元 1561—1626); 一个是法国的笛卡儿(公元 1596—1650)。两人虽然在哲学的基本倾向上不同, 性格也各异, 但他们都是看到了新科学的未来前景的人, 并用一种新哲学激励人们去为新科学的发展而奋斗。培根是一位坚持唯物主义传统的哲学家, 在 17 世纪的哲学家中, 他以尊重工匠传统而著称。他认为, 当时学术上的弊端, 一方面是学者不和工匠的经验接触; 另一方面则是工匠没有学问, 他主张学者传统要和工匠传统结合起来, 从而形成“经验和理性职能的真正的合法的婚配”。这种结合将使工匠的手艺因运用科学方法变得更有成效; 学者们则从实际经验中获得教益, 并提高自己的水平。在他看来, 很多科学原理蕴藏在工匠的日常操作中, 这些操作经验是科学的可贵源泉。培根继承了罗吉尔·培根、达·芬奇等人的思想, 强调了实验对科学的极端重要性, 同时重视理性的作用, 最后建立了实验归纳法。培根认为, 要得到正确的知识必须从事实出发, 通过实验收集大量资料, 然后进行对比分析, 排除无关因素, 找出个别事物中的普遍规律。在 《新工具》 一书中, 他不仅阐明了归纳法的重要性,而且提供了归纳逻辑中判明因果联系的求同法、差异法和共变法。 培根一生并没有作过一次实验, 没有提出一个自然科学概念,但不能因此而否定他对科学发展的贡献。他除了对建立实验科学方法论有贡献外, 在科学的重要社会功能的认识上, 提出了“要征服自然, 必须服从自然”的思想。由于人对自然的科学理解和对自然的技术控制是相辅相成的, 因而培根又提出了“知识就是力量”的口号。他在乌托邦 《新大西岛》 一书中, 勾画了建立学者们的合作团体的计划, 强调了学者们集体合作研究的重要性。在这种思想的倡导下, 17 世纪陆续建立了一批对后来科学发展有影响的科学组织。马克思和恩格斯在评价他的贡献时指出: “英国唯物主义和整个现代实验科学的真正始祖是培根。”“按照他的学说, 感觉是完全可靠的, 是一切知识的泉源。科学是实验的科学, 科学就在于用理性方法去整理感性材料。归纳、分析、比较、观察和实验是理性方法的主要条件。”笛卡儿则倡导科学研究中的演绎法, 强调数学方法的意义。笛卡儿是法国著名的数学家, 他把代数方程和几何学的曲线、曲面联系起来, 创立了解析几何学, 使辩证法进入了数学, 并奠定了近代数学———实验方法的基础。他继承了伽利略等人的思想, 认为科学与数学在本质上是同一的。在哲学上他是近代唯理论的代表, 强调理性在整个认识过程中的作用, 主张依靠人的理性来寻求可靠的知识。他认为科学始于怀疑, 倡导理性演绎法。他认为只有从不可怀疑的或不证自明的公理出发, 严格按照演绎法一步一步地进行推理, 才能推演出可靠的知识。他在一定程度上看到了单凭经验不能提供关于事物的本质的知识, 但认为理性是一切知识的泉源又是片面的。不过他并不排斥实验, 认为实验的功能在于确立演绎的结果与物理实验之间的一致性, 这又与培根的思想产生了共鸣。笛卡尔致力于自然界观察，并意识到只有牵涉空间的“运动”可以用数学处理。作为解析几何的创始人，笛卡尔把数和几何学联系起来，从而表明空间或广延可以用代数公式表示。“他又引入现代数学符号以及运作方式，并且用x，y等字母代表未知线段，用a，b，c等字母代表已知数量，从而大大简化了代数问题的解决。这在数学的现代革命过程中是具有重大意义的决定性一步，从此数学思考的重心就从几何学的“形”转移到代数学的“计算”上去了。由此，笛卡尔把科学的统一性建立在研究方法——数学上，而数学的确定性就保证了知识的确定性，从而在数学角度为近代科学建立了形而上学的基础。培根与笛卡儿的观点似乎是相互对立的, 其实他们是互相补充的。注重实验经验成为英国皇家学会和早期法国科学院的一项宗旨。18 世纪和以后的一些法国科学家奉行笛卡儿的原则, 在理论的创造上作出了贡献。培根和笛卡儿都对科学的前景给予充分估计, 相信自然科学将使人类成为自然界的统治者和占有者, 并将给人类带来更多的利益。 由于伽利略、培根、笛卡儿所倡导的科学精神的传播, 使一批科学家受到了感染。为促进实验科学的发展, 一批有影响的由科学家组成的社团, 陆续在各国建立。13 世纪以来建立的大学本来应该在发扬新科学的精神方面作出贡献, 然而由于教会的控制, 不仅把哲学变成了神学的婢女, 大学也变成了希腊童话中的灰姑娘。在近代科学产生时, 近代科学的先驱者们完全脱离了大学。为了适应新时代的需要, 必须有新的脱离教会控制的新组织。科学社团正是在这种需要中建立起来的。在最早建立的科学社团中, 最有影响的有佛罗伦萨的西芒托学院或称实验学会。这是由伽利略的两个杰出的学生维维安尼(公元1622—1703)、托里拆里(公元 1608—1647)发起建立的。在正式建立之前, 已经有了一个由贵族资助的实验室, 配备有就当时来说很完善的科学仪器。各方面的科学家为了进行实验和探讨问题经常到这里来聚会。西芒托学院是由这种非正式组织发展而来的。在这个实验学会里, 科学家们进行了许多实验, 如关于空气压力的实验,水和其液体的凝固实验, 还对固体和液体的热膨胀、电和磁的基本现象进行了研究。他们采用精密的实验方法, 依观察实验的证据提出结论, 而不靠思辨的遐想。由于这是一种合作研究, 彼此间可以相互批评, 为使别人接受自己的结论, 惟一有效的办法就是要提供实验观察和计算的结果。以至于后来英国的皇家学会也是这样对思辨加以限制的。牛顿之所以厌恶科学上的思辨假说也是出于类似的原因。西芒托学院完全是由科学家自发组成的学术团体, 因缺乏支持仅活动了 10 余年便中止了。 英国的皇家学会是由培根的实验哲学的追随者们的一个非正式团体发展而成的。大约从 1645 年开始, 以威尔金斯(公元 1614—1672)为首的一批年轻科学家每周在伦敦集会。在这个自称为“哲学学会”的组织里, 他们进行实验和讨论科学问题, 涉及领域极其广泛, 但其成员约定神学和政治不在他们讨论的范围之内。由于人员迁居和政治动乱, 哲学学会的活动曾中止一个时期, 到 1660 年,伦敦的科学家们又恢复集会, 并提出建立正式的科学机构, 目的在于探索实验知识。1662 年 7 月 15 日, 蒙英王查理二世之特许, 创立了皇家学会, 创办时成员大约有 100 人。皇家学会一开始就形成一种制度, 即在学会的会议上把具体的探索任务或研究项目分配给会员个人或小组, 并要求他们及时向学会汇报研究成果。因此, 在早期的学会会议上, 都是会员作报告或演说, 演示实验, 展览各种稀奇的东西, 并对由此而提出的各种问题进行讨论。随着时间的推移, 逐渐又建立了各种专门委员会, 用以推进各部门的活动。各学科委员会不仅进行关于天文学、生物学、化学等基础理论的研究,还重视各种技术原理与工艺实践的研究, 反映了这一时期英国科学与生产联系的特点。1633 年由学会干事胡克起草的学会章程中明确规定: “皇家学会的任务和宗旨是增进关于自然事物的知识和一切有用的技艺、制造业、机械作业、引擎和用实验从事发明。”英国皇家学会通过开展活动, 包括出版 《皇家学会哲学学报》,不仅吸引了当时英国的一大批杰出的科学家, 激发了他们的创造活动, 在各个领域作出贡献, 同时对各国的科学家也产生了深远影响。几乎与此同时, 在法国也有一批哲学家和科学家开始进行非正式的聚会活动, 到 1666 年经法国国王路易十四特许, 成立了皇家科学院, 有 12 位科学家被委任为院士, 院士由国王发给薪俸, 研究工作也得到国王的资助。17 世纪的德国也建立了许多社团, 诸如自然研究学会、实验研究学会等。但是真正能与英国皇家学会、法国科学院并驾齐驱的德国科学社团则是柏林学院。这所学院是由微积分的创始人之一莱布尼兹(公元 1646—1716) 经多年规划和不断鼓吹的结果。虽然直到 1700 年才正式建立, 但必须将其看做是17 世纪的产物。在科学社团的支持下, 开始出现了学术交流和传播知识的新手段, 即科学期刊。如英国皇家学会的 《皇家学会哲学学报》, 法国科学院的 《皇家科学院史以及数学和物理的论文报告》、《外国学者论文报告集》, 柏林学院也创办了自己的杂志。科学社团的建立, 促进了实验科学的发展, 随之也推动了科学仪器的进步。显微镜、望远镜、温度计、气压计、抽气机、摆钟和一些船用仪表都是在实验活动中, 由科学家们发明的。以前的工具是由工匠们在生产实践中创造出来的。科学工具是从实验室里创造出来的, 但同时它们也在人类的其他活动中加以应用。当然, 这时的科学工具相对来说,还是比较简陋的, 但毕竟有了一个新的开端。初期科学社团的建立, 标志着科学活动方式的转变, 即从科学家的个人自由研究转向有组织的集体研究。它使科学成为一种社会建制, 变成了一种广泛的社会活动。科学家们正是在这种有组织的社会活动中, 取得了杰出的科学成果。牛顿的力学体系也正是在这样的条件下诞生的。
伽利略·伽利雷（Galileo Galilei，1564-1642），意大利著名数学家、物理学家、天文学家和哲学家，近代实验科学的先驱者。 1590年，伽利略在比萨斜塔上做了“两个球同时落地”的著名实验，从此推翻了亚里士多德“物体下落速度和重量成比例”的学说，纠正了这个持续了1900年之久的错误结论。 1609年，伽利略创制了天文望远镜（后被称为伽利略望远镜），并用来观测天体，他发现了月球表面的凹凸不平，并亲手绘制了第一幅月面图。1610年1月7日，伽利略发现了木星的四颗卫星，为哥白尼学说找到了确凿的证据，标志着哥白尼学说开始走向胜利。借助于望远镜，伽利略还先后发现了土星光环、太阳黑子、太阳的自转、金星和水星的盈亏现象、月球的周日和周月天平动，以及银河是由无数恒星组成等等。这些发现开辟了天文学的新时代。 伽利略著有《星际使者》《关于太阳黑子的书信》《关于托勒密和哥白尼两大世界体系的对话》和《关于两门新科学的谈话和数学证明》。 为了纪念伽利略的功绩，人们把木卫一、木卫二、木卫三和木卫四命名为伽利略卫星。 人们争相传颂：“哥伦布发现了新大陆，伽利略发现了新宇宙”。 伽利略为牛顿的牛顿运动定律第一、第二定律提供了启示。他非常重视数学在应用科学方法上的重要性，特别是实物与几何图形符合程度到多大的问题。
斯坦利是美国生化学家和病毒学家，1904年8月16日出生于印第安纳州。在伊利诺斯州立大学取得博士学位，在普林斯顿病理实验室从事植物病理学研究。他首先用盐析法从植物细胞中分离出传染性病毒的晶体蛋白，提示了病毒能通过细胞遗传的反应机理，开辟了研究癌症的重要途径，推动了病毒学的研究，因而于1946年分享诺贝尔化学奖。1971年6月15日病逝于西班牙，终年67岁。
斯坦利的父亲詹姆士·G·斯坦利是当地的报纸出版商。斯坦利本科就读于印第安纳州的厄尔汉姆学院(Earlham)，大学期间的他非常喜欢化学和数学，也爱好足球，他最初的理想是当一名足球教练。
在本科毕业前夕，斯坦利拜访了伊利诺伊大学化学系系主任——著名的化学家罗杰·亚当斯(Roger Adams)教授，教授在谈话中所流露出的对化学的狂热和执著感染了斯坦利，他决定放弃做一个足球教练的职业梦想，转而投身于化学研究，于是他本科毕业后在罗杰·亚当斯教授门下学习化学，先后获理学硕士学位(1927年)和化学博士学位(1929年)。在此期间他主要的研究方向在化学制药方面。在伊利诺伊大学做了一年的博士后之后，斯坦利以国家研究委员会研究员的身份赴德国做访问学者，德国是当时世界化学制药研究的中心，在慕尼黑大学，斯坦利曾经跟随1927年诺贝尔化学奖得主海因里希·维兰德做过短期的学术研究。1931年斯坦利回到美国，时逢经济大萧条，但他设法在纽约的洛克菲勒(Rockefeller)研究所找到了一个研究助理的位置。
1932年斯坦利开始对烟草花叶病展开研究。在那个时代，烟草花叶病传染快、破坏性极强，其病原物烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，简称TMV)在普通显微镜下无法观测到。烟草花叶病每年给烟农造成很大的损失，尽管国际上有一些学者对烟草花叶病毒展开研究，但对其性质和结构，人们猜测的成分居多，缺乏令人信服的证据。
1935年，当时在普林斯顿大学动植物病理学实验室进行研究的斯坦利发现烟草花叶病毒的侵染性能被胃蛋白酶破坏，在这一现象的启示下，他开始怀疑病毒是由蛋白质构成的。斯坦利于是决定分离、提纯烟草花叶病毒。
斯坦利找来了一吨多的感染花叶病的烟叶，逐一进行研磨、过滤，他想用提取酶的方法把病毒提纯出来，但极低的提取率使其工作的艰辛程度不亚于居里夫人从沥青中提取镭。一段机械而枯燥的时光过去后，最终他得到了一小匙在显微镜下看来是针状结晶的东西，把结晶物放在少量水中，水就出现乳光了，用手指沾一点此溶液，在健康烟叶上摩擦几下，一星期以后这棵烟草也得了同样类型的花叶病。他宣布提纯的东西就是有侵染性的烟草花叶病毒。今天在美国加州大学的原斯坦利实验室里，仍然保留着一个标注着“.”字样的瓶子，瓶里就盛放着斯坦利当年第一次提纯的烟草花叶病毒。
接下来斯坦利开始对这种提纯的病毒展开研究。根据各种试验结果，证实这种结晶物质是蛋白质，初步的渗透压和扩散测定表明，这种蛋白质的分子量高达几百万。其结晶制品的侵染性依赖于蛋白质的完整性，侵染性被认为是病毒蛋白质的一种性质。斯坦利的研究论文陆续发表在《Science》等著名杂志上，他在论文中写道：“烟草花叶病毒是一种具有自我催化能力的蛋白质，它的增殖需要活体细胞的存在”。斯坦利这一时期著名的工作，后来被誉为基础病毒学的经典之一。也正是这一时期的工作，使他和萨姆纳(James Batcheller Sumner)、诺思罗普(John Howard Northrop)一起共获1946年的诺贝尔化学奖。
然而，斯坦利在他的烟草花叶病毒研究工作中，并未注意到病毒的含磷和糖类组分，1936年英国的鲍顿(Bawden)和皮里(Pirie)在纯化的烟草花叶病毒中发现了含磷和糖类的组分，它们以核糖核酸的形式(即RNA)存在，通过热变化，这种核酸可以从病毒粒子中释放出来。消息传来，斯坦利最初的反应是反对这一结论，他为此不惜在多次学术会议上与持异议者展开辩论，但科学是以实验为依据的，斯坦利重复英国小组的实验后发现自己错了，他不得不对此保持缄默。真理越辩越明，科学家们终于对烟草花叶病毒由蛋白质和RNA组成达成共识。1939年，在电镜下直接观察到了烟草花叶病毒，指出烟草花叶病毒是一种直径为，长为300nm的长杆状的颗粒，此后的研究证明烟草花叶病毒颗粒的内部是核酸，外面包裹着蛋白质。烟草花叶病毒的化学结构之谜终被科学家解开。
在斯坦利研究烟草花叶病毒取得成功之后，越来越多的学者投入病毒学领域，烟叶花叶病毒也成为众多病毒研究手中必不可少的研究对象。面对病毒学的飞速发展，斯坦利认为有必要建立一个专门的病毒学实验室。在获得诺贝尔奖之前几个月，斯坦利在飞机上偶然遇见了加州大学校长史普劳尔(Robert )。在交谈过程中斯坦利提出了建立专门的病毒实验室的设想，以便对病毒学展开全方位研究。1948年史普劳尔邀请斯坦利在伯克利(Berkeley)校园筹建一所病毒实验室并出任实验室主任，斯坦利的希望变成了现实。在伯克利病毒实验室，斯坦利坚持工作到退休，他还曾兼任过加州大学生物化学系主任，培养了一代病毒学者，指导完成了许多研究计划，这些计划对于进一步澄清病毒的本质作出了杰出的贡献，而且开发出了许多新疫苗，小儿麻痹症疫苗就是其中之一。病毒学的飞速发展，使越来越多的植物病毒和动物病毒的化学结构被人类阐释，在此基础上的动植物病理防治也取得了长足进步，危害人类的许多病毒性疾病不再是不治之症，人类的健康和生命保障能力得到了加强。《纽约时报》这样评价斯坦利：一个眼中闪烁着智慧光芒的和蔼可亲的国家医生。
斯坦利的学术贡献主要在化学制药、联苯立体化学和甾体化合物的研究上，他一生在学术刊物上共发表了150余篇论文，是全世界公认的研究病毒的权威。他曾著有《化学:美丽的事物》一书，该书曾获得著名的普利策奖的提名。
许多人把斯坦利的成就与发现细菌的巴斯德(Pasteur)的成就相提并论。纵观斯坦利的一生，除获得1946年诺贝尔化学奖之外，他还获得过许多荣誉和奖项：1937年获美国美国科学促进协会颁发的科学进步奖，1938获罗森伯格奖章（芝加哥大学）、阿尔德奖（哈佛大学）和斯科特奖（费城）;1941年获美国纽约学院金牌；1943年获哥白尼奖；1946年获尼科尔斯奖章（美国化学学会）;1947年获吉布斯奖章（美国化学学会）；1948年获富兰克林奖章和总统勋章;1958年获现代医学奖；1963年获美国癌症协会为控癌著名人士颁发的奖章。除这些外，他还获得许多大学和学院授予的荣誉博士和科学学位，包括厄勒姆姆学院、哈佛大学、耶鲁大学（1938年）；普林斯顿大学（1947）和伊利诺伊大学（1959年）;加州大学（1946年）和印第安纳大学（1951年）的名誉法学博士，美国犹太神学院（1953年）和米尔斯学院（1960年）以及巴黎大学的荣誉博士（1947年）学位。
他还应邀担任许多学术团体和医疗组织的顾问，并任美国政府和世界卫生组织科学顾问。他美国癌症协会资深主任、国立癌症研究所科学顾问理事会成员。他还是许多科学协会的会员。知识点斯坦利的争议
1946年斯坦利荣获了诺贝尔化学奖后，鲍顿和皮里认为这是诺贝尔奖历史上的错误，对此感到愤愤不平，因为斯坦利最初认为烟草花叶病毒由蛋白质组成这一认识是不完全的，而且是他们纠正了斯坦利的错误(查询斯坦利1935年至1945年发表的论文，你会认为鲍顿和皮里的愤愤不平是有道理的)。但时至今日，纵观斯坦利献身科学的一生，以及他在病毒学上取得的巨大成就，许多学者认为他无愧于诺贝尔奖，今天的病毒学界仍然公认斯坦利是第一个阐明烟草花叶病毒实质的科学家。
显微镜毕业论文
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【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 ( to ), HLADR ( to ), CD83 ( to ), CD86 ( to ) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(±) ng/L to (±) ng/L, P＜〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(上升至)，HLADR(上升至)，CD83(上升至)，CD86(上升至)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(±→±，P＜)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 统计软件分析.2结果 总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83低表达，仅；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83 ，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（±) ng/L vs (±) ng/L； n=6，P＜〕. 介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（±）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(±)%和(±)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. 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高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. 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显微镜技术的研究进展论文
G.伽利略在1609年，根据望远镜倒视有放大物体的效应，制成一台复合显微镜，并对昆虫进行了观察。英国物理学家R.胡克于1665年用自制的复合显微镜观察软木薄片，发现有许多蜂窝状小空室并称之为细胞(cell)。这个名词一直沿用至今。这张软木显微结构图，登载于1665年英国出版的《显微图谱》上。他还对鱼鳞、蜜蜂螫针、家蚕卵、家蝇的头和足以及跳蚤等进行了精细的描绘。意大利解剖学家M.马尔皮基开创了动物与植物的显微解剖工作。1660年他通过向蛙肺动脉注水的方法，发现有连接动脉与静脉的毛细血管，证实了W.哈维未能观察到的由毛细血管连接动、静脉的血液循环。他描述了肝脏的微细结构，舌的乳头突，大脑皮层，以及用他名字命名的肾小体和皮肤微细结构等。他对家蚕进行了显微解剖，发现同样具有复杂的微细结构。他关于家蚕的著作是无脊椎动物方面的第一本专著。他对不同的植物进行了比较研究，系统地描述了植物各部分的结构，指出单子叶植物与双子叶植物间的区别，以及虫瘿是由昆虫引起等。并且提出植物的各部分是由“小囊”（即细胞）组成的。他在植物解剖方面的许多精确绘图未能为当时的植物学家所理解，直到19世纪才被重新认识。英国植物学家N.格鲁在显微镜下发现植物叶面有气孔，它们可使植物体内的水分蒸发并吸入空气。他发现植物的组织是由多孔的小胞（即细胞）所组成，但他经 常描述的只是小胞的壁。他认识到花是植物的生殖器官，可区分为萼、花冠、雄蕊与雌蕊，并指出雌蕊、雄蕊和花粉分别相当于雌性器官和雄性器官，而且植物一般是雌雄同体的。他的著作《植物解剖》由M.马尔皮基译成拉丁文，流传了100多年后才有人做了一些重要补充。荷兰显微镜学家 列文虎克自制了许多性能优良的显微镜,最高的放大倍数达270倍。他通过大量细微的观察，解释并完善了M.马尔皮基提出的关于毛细血管系统的知识，证明动脉与静脉分别和毛细血管直接相连。他发现人和哺乳类的红细胞是无核的，而鸟类、两栖类、鱼类的红细胞是有核的；发现了人的精子，并研究了各种动物特别是鱼和蛙的受精作用；还发现了许多小的水生生物，如轮虫、水螅、纤毛虫等。还在19世纪显微镜改进之前，他首先看到并记述了细菌，实属难得。荷兰显微镜学家J.斯瓦默丹对不同类型的昆虫发育 做了许多研究。他的著作《昆虫志》、《蜉蝣的生活》 中有许多出色的显微解剖图，如昆虫的神经节，气管系 统等。他去世几十年后出版的《自然的圣经》是当时显微镜观察的最好著作，其中对蜜蜂内部器官、蚊子、蜻蜓发育的描述，都非常精确但由于复合显微镜的色差问题，使这方面的工作在其后的100多年内没有多大进展。
海兹思专业做原子力显微镜。
目的：运用原子力显微镜(AFM)表征3种DNA纯化试剂盒对DNA的纯化效果。方法：PCR扩增K562/A02细胞mdr1基因DNA,分别以3种不同的DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，按终浓度为10 ng・μl-1固定在用1 ng・μl-1 L型多聚赖氨酸预先处理过的新剥离的云母片上，用AFM获取DNA扫描图像，分析评价3种DNA试剂盒对DNA的纯化效果。结果:用AFM成功表征3种纯化试剂盒纯化后DNA片段，获得了清晰的DNA图像。对3种DNA纯化试剂盒的纯化效果作出评价，建议其中的两种DNA纯化试剂盒的DNA纯化产物可用于AFM的DNA 分析。结论：用AFM表征DNA时对DNA的纯度要求较高。通过对3种DNA纯化试剂盒纯化效果的比较，为AFM观测DNA样本的纯化方法提供了较好的方案。〔关键词〕原子力显微镜;表征;脱氧核糖核酸;纯化Abstract：Objective To identificate purification effect of three kinds of DNA purification kits by atomic force microscopy(AFM).Methods Cultivateion and PCR technique was used to amplify K562/A02 cells with DNA of mdr1gene. The amplified products were purified by three kinds of DNA purification kits， a final concentration of 10 ng・μl -1 DNA samples were placed on a freshly cleaved mica treated by 1ng・μl -1 was used for the imaging of the three pieces of DNA Through AFM image analyzing, the purification effect of three kinds of DNA purification kits was evaluated, two kits can be used to purify DNA samples for AFM imaging. Conclusion The higher the purify of DNA sample used, the better the AFM image got. Two better purification schemes have been achieved for DNA imaging using AFM through comparing three kinds of DNA purification words：atomic force microscope ; identification；deoxyribonucleic acid; purification原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）是具有原子级分辨率的新一代显微镜，因其能够对DNA、蛋白质、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物的形态及功能进行观察研究而引起了人们的广泛关注〔1〕。近十几年，运用AFM在固相载体表面研究DNA分子技术取得的巨大进步, 大大地增进了人们在分子层面上对DNA分子的了解〔25〕。AFM在样本制备上相对较容易，但用于DNA研究时，要想得到质量较高的DNA图像对DNA样品的纯度要求较高。我们选择了3种不同的DNA纯化试剂盒对K562/A02细胞株mdr1基因769bp DNA的PCR产物进行纯化后在相同条件下用AFM观测，通过比较，建议其中的两种可用于AFM的DNA样品的纯化。1 材料和方法 细胞培养K562/A02细胞株由中国医学科学院血液学研究所杨纯正、齐静老师惠赠。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司产品)培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，2~3d传代1次，实验前无药培养两周。 DNA提取取对数生长期、终浓度2×105ml-1的K562/A02细胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100μl TE缓冲液于-20℃保存。用紫外分光光度计定量，要求A260/A280≥。 PCR扩增从基因库中查得所需mdr1的基因序列号，引物根据基因库提供的基因全序列用