蓝莓果实中含有碳水化合物、纤维素、半纤维素、脂肪及蛋白质等营养成分，钙、铁、锌和维生素等微量营养素，以及多种功能因子，具有抗氧化、改善视力、预防心血管疾病、保肝等功效。蓝莓酵素含有丰富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，以及酚类、维生素、黄酮类等次生谢产物，具有抗炎抑菌、净化血液、抗衰老、增强免疫力等作用。为此以蓝莓为原料，采用酵母菌作为发酵菌种，制备一种蛋白酶活力与SOD酶活力较高的功能性酵素产品，为生产实践提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓：黑龙江省大庆市农贸市场；葡萄酒专用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；Pectinex XXL果胶酶 （酶活 14 000 U）：Novozyme诺维信公司；福林酚试剂：国药集团化学试剂有限公司；SOD酶活力检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

手持式折光仪：河北润联科技开发有限公司；电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；EX324电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡离心机：金坛市城西春兰试验仪器厂；UV-1100紫外-可见分光光度计：上海凌析达仪器；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司。

1.3 工艺流程与操作要点

蓝莓→清洗、破碎→酶解→调糖→灭菌→冷却→接种→发酵→酵素产品。

1.3.1 酶解 蓝莓清洗破碎之后经Pectinex XXL果胶酶酶解，果胶酶添加量为2.4 mL/kg，于50℃酶解2 h。

1.4.4 接种量的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，发酵初始pH 4.0，设置酵母菌接种量分别为0.10%，0.15%，0.20%，、0.25%，0.30%，灭菌后在 25 ℃条件下发酵2 d，测定蛋白酶和SOD酶活力，确定酵母菌最佳接种量。

1.3.3 灭菌 采用巴氏杀菌方式对蓝莓果汁进行灭菌，85℃灭菌15 min后冷却至室温。

1.3.4 菌种的活化 高活性干酵母用10倍蒸馏水溶解，于35℃恒温水浴锅中活化30 min，备用。

实验选取宜昌地区高坝州水电站坝肩右岸边坡(A)、清江水布垭三友坪公路边坡(B)、三峡大学信息技术楼侧边坡(C)为研究坡地，研究样地描述如表1所示，三处均为岩质边坡，均采用植被混凝土生态防护施工工艺，边坡初始条件及后期管理养护条件等无较大差异。

1.4 酵母菌发酵单因素试验

1.4.1 发酵时间的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，酵母菌接种量 0.2%，发酵初始 pH 4.0，灭菌后置于 25 ℃发酵，发酵时间设定为 1，2，3，4 d，测定蛋白酶活力和SOD酶活力，确定最佳发酵时间。

1.4.5 正交试验 依据单因素试验结果，以发酵时间、发酵温度、发酵液初始pH和接种量4个因素进行L9（34）正交试验，确定酵母菌发酵蓝莓果汁的最佳工艺条件。正交试验因素水平见表1。

肝胆部手术患者临床肝功能检验一般均在正常范围,术前凝血状态、肝代谢功能以及麻醉药物与其他药物的药代动力学状态也接近正常。因此,术中管理的焦点主要是维持血流动力学的稳定、尽可能维持有效的肝血流以保持较好的肝氧供耗比、保护支持肝脏的代谢。由于肝叶切除术中血流动力学及液体平衡往往波动显著,所以对这些病人应有较充分的术前准备和良好的术中监测。动脉导管可用来监测动脉压和采集动脉帆样,中心静脉压、肺动脉压、心输出量、尿量监测对血容量和心功能评估均是有益的,同时体温和神经肌肉阻滞程度也可监测[8]。

1.4.3 初始pH的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，酵母菌接种量0.2%，设置发酵初始pH分别为3.6、3.8、4.0、4.2，灭菌后在 25 ℃条件下发酵 2 d，测定蛋白酶和SOD酶活力，确定最佳发酵初始pH。

2.1.1 酵母菌发酵时间对蓝莓酵素酶活力的影响 发酵时间对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响如图1所示。

1.3.2 调糖 在室温条件下，将白砂糖直接加入到蓝莓果汁中，通过手持糖度仪测定糖度，将其糖度调整至18%。

（2）提高组织领导能力。基层党支部书记应具有能够组织、动员各方面力量去围绕上级党委行政的工作重点和单位的中心工作开展工作的能力；作为基层支部书记，虽然不是处于行政“领导”的地位上，但个人的思想水平、业务素质、个人品德等是构成支部书记有组织领导才能的重要因素，因此，支部书记应该经常和党员进行谈心，为他们办实事，帮助其提高认识，这样才会赢得同志们的信赖和拥护。

1.4.2 发酵温度的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，发酵初始 pH 4.0，酵母菌接种量 0.2%，灭菌后发酵液分别在19，22，25，28℃条件下发酵2 d，测定蛋白酶活力和SOD酶活力，确定最佳发酵温度。

 

表1 正交试验因素水平Table 1 Orthogonal test factor level

  

水平 A发酵温度/℃ B发酵时间/m i n C初始p H D接种量/%1 2 2 ℃ 1 d 3.6 0.1 5%2 2 5 ℃ 2 d 3.8 0.2 0%3 2 8 ℃ 3 d 4.0 0.2 5%

1.5 指标测定

1.5.1 蛋白酶活力 蓝莓酵素蛋白酶活力测定参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》。

三是走进社区，与群众开展“零距离”宣传。为适应新时期城市群众工作新要求，区委区政府结合渝中区实际策划实施“社区工作日”活动，“零距离”听民声、纳民意、解民难、化民怨，得到辖区群众高度认可。多年来，已成为干部下访群众的一个品牌。区委宣传部、政法委依托社区工作日这一平台，在全区78个社区同步开展扫黑除恶专项斗争宣传，面对面宣传相关政策，打通宣传“最后一米”，营造全民知晓、全民参与的浓厚氛围。

周六，一位朋友讲述了父亲这两年的改变：他声称自己什么都干不了，不能去银行，不能去超市，不能去菜市场，一切都推给同样过了80岁的老伴料理；他没完没了地看电视，卸掉了身上的一切责任，似乎还对此相当满意。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵单因素试验

参照GB/T 27404-2008的有关精密度的规定，选择6个参与测试的人员在相同实验室，按照同一方法，采用不同设备，检测相同样品，进行重复性验证。本研究选取了三个水平的标准物质作为待测样品，三种方法的变异系数与标准方法的比较见表2。

  

图1 发酵时间对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 1 Effect of fermentation time on the activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由图1可知：随着发酵时间的延长，酶活力逐渐增加，发酵第2 d蛋白酶活力达到最高；发酵第3 d出现蛋白酶活力下降现象，此后趋于稳定状态。蛋白酶活力下降的原因是，发酵过程中产生有机酸，使发酵体系的pH降低，从而抑制酶活力。

综合两种酶活力的大小，确定酵母菌发酵蓝莓酵素的最佳发酵时间为2 d，蛋白酶活力与SOD酶活力分别为 22.92 U /mL 与 28.04 U /g。

由图1还可知：随着发酵的进行，SOD酶活力不断增加，发酵第3 d酶活力达最大；发酵第4 d出现酶活力下降现象，可能是发酵产生的有机酸抑制了活力。

1.5.2 SOD酶活力 蓝莓发酵液离心，取上清液，根据SOD酶试剂盒说明书进行酶活力测定。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)传统的定义是长度大于200碱基的RNA链，并且无蛋白质编码能力。现有的研究表明lncRNA可以参与调控转录[7]、翻译[8-10]、蛋白质细胞定位。本文试图找寻新的可能有重要功能的lncRNA，通过挖掘TCGA胶质瘤数据库发现lncRNA ASB16-AS1在胶质瘤组织中显著上调(P<0.001)，且ROC曲线的曲线下面积>0.85，这证明了lncRNA ASB16-AS1有深入研究价值。在本实验中我们证实lncRNA ASB16-AS1能促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移。

2.1.2 酵母菌发酵温度对蓝莓酵素酶活力的影响 发酵温度对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响见图2。

  

图2 发酵温度对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 2 Effect of fermentation temperature on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由图2可知：在19℃时，蛋白酶与SOD酶活力最低，酵母菌发酵的速率最低；随着发酵温度的上升，蛋白酶与SOD酶活力明显上升，在25℃时达到最大值，温度上升到28℃时，蛋白酶活力稍有下降，而SOD酶活力下降明显，说明SOD酶活力受温度的影响较大。综上所述，酵母菌发酵最适温度为25℃。

约束条件为：0.072≤t1≤0.29 & 0≤t1≤0.7;0.1≤t2≤0.46 & 0≤t2≤0.16;0.033≤t3≤0.16 & 0≤t3≤0.4。

2.1.3 发酵液初始pH对蓝莓酵素酶活力的影响 发酵初始pH对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响见图3。

  

图3 发酵初始pH对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 3 Effect of initial pH of fermentation on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由图3可知：pH为3.6时，蛋白酶及SOD酶的活力较低，可能是酶活力受到抑制；发酵初始pH上升到3.8时，蛋白酶活力及SOD酶活力显著；提升并达到最高值；发酵初始pH大于3.8，功效酶的活力明显下降，不利于酵母菌发酵。综上所述，蓝莓酵素的最佳初始 pH 为 3.8。

2.1.4 酵母菌接种量对蓝莓酵素酶活力的影响 接种量对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响见图4。

  

图4 接种量对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 4 Effect of inoculation amount on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

如图4所示：酵母菌接种量由0.10%增加到0.20%时，蛋白酶活力逐渐增加并达到最大值；随着接种量的增加，发酵液中的氧气和营养物质消耗过多，不利于发酵，蛋白酶活力呈下降趋势；当接种量达0.15%时，SOD 酶活力达到最高，为 30.23 U/g。 故最佳酵母菌接种量为0.20%。

2.2 酵母菌发酵蓝莓酵素的工艺条件优化

酵母菌发酵蓝莓酵素正交试验设计及结果见表2。

由表2极差分析可知：酵母菌发酵对蓝莓酵素蛋白酶活力影响的主次顺序为B＞C＞D＞A，发酵时间对蛋白酶活力影响最大，其次为发酵初始pH，发酵温度与接种量对蛋白酶活力的影响最小；由K值可知，使蛋白酶活力最大化的最优组合为A1B3C1D1，即发酵温度 22 ℃，发酵时间 3 d，初始 pH 3.6，接种量 0.15%；酵母菌发酵对SOD酶活力影响因素的主次顺序为B＞A＞D＞C，发酵时间对SOD酶活力的影响因素最大，其次为发酵温度，接种量与发酵初始pH对SOD酶活力的影响较小；由K’值可知，使SOD酶活力最大化的最优组合为A3B3C2D2，即发酵温度28℃，发酵时间3 d，初始 pH 为 3.8，接种量为 0.20%。

 

表2 酵母菌发酵蓝莓酵素正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results of yeast fermentation blueberry enzyme

  

试验号 因素蛋白酶活力（U/m L） S O D 酶活力（U/g）A发酵温度/℃ B发酵时间/d C初始p H D接种量/%1 1（2 2） 1（1） 1（3.6） 1（0.1 5） 2 7.8 1 2 5.0 1 2 1 2（2） 2（3.8） 2（0.2 0） 2 2.1 0 4 8.4 3 3 3（3） 3（4.0） 3（0.2 5） 2 6.1 8 5 1.9 4 4 2（2 5） 1 2 3 1 8.9 7 2 4.8 8 5 2 2 3 1 1 9.7 9 3 6.7 6 1 6 2 9.9 2 5 0.2 7 7 3（2 8） 1 3 2 2 0.9 4 3 2.9 0 8 3 2 1 3 2 2.7 8 4 5.0 9 2 3 1 2 2 9.5 1 5 5.1 1 K 1 7 6.0 9 6 7.7 2 8 0.5 1 7 7.1 1 蛋白酶活力 A 1 B 3 C 1 D 1 K 2 6 8.6 8 6 4.6 7 7 0.5 8 7 2.9 6 K 3 7 3.2 3 8 5.6 1 6 6.9 1 6 7.9 3极差 R 7.4 1 2 0.9 4 1 3.6 0 9.1 8最优水平 A 1 B 3 C 1 D 1 K 1’ 1 2 5.3 8 8 2.7 9 1 2 0.3 7 1 1 6.8 8 S O D 酶活力K 2’ 1 1 1.9 1 1 3 0.2 8 1 2 8.4 2 1 3 1.6 0 A 3 B 3 C 2 D 2 K 3’ 1 3 3.1 0 1 5 7.3 2 1 2 1.6 1 2 1.9 1极差 R’ 2 1.1 9 7 4.5 3 8.0 5 1 4.7 2最优水平 A 3 B 3 C 2 D 2 9 3 3 2 1

2.3 最佳工艺条件验证试验

最佳工艺条件验证试验结果见表3。

由表3可知：组合A1B3C1D1的蛋白酶活力最高为29.85 U/mL，组合 A3B3C2D2SOD的酶力最高为55.93 U/g；两种发酵条件下蛋白酶活力差异不大，而A3B3C2D2的SOD酶活力明显高于正交最优组合A1B3C1D1。因此，蓝莓酵素最佳的发酵工艺条件为：发酵温度 28 ℃，初始 pH3.8，接种量 0.20%，发酵时间 3 d。在此条件下，蓝莓酵素的蛋白酶活力为29.76 U/mL，SOD 酶活力为 55.93 U/g。

 

表3 最佳工艺条件验证试验Table 3 Verification test for optimaltechnical condition

  

酶活力/（U/g）5 0.4 3 5 5.9 3

3 结论

经单因素试验和经正交试验优化后，蓝莓酵素的最佳工艺条件为：发酵温度28℃，初始pH为3.8，接种量为0.20%，发酵时间为3 d。在此条件下蛋白酶活力达到 29.76 U/mL，SOD 酶活力达到 55.93 U/g。 说明通过酵母菌发酵，可以制备蛋白酶活力与SOD酶活力较高的蓝莓酵素产品。

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