祁锋发表论文
他说的挺详细的，咱就打个酱油吧。
延安是中国革命的摇篮。它记载中国革命的历史，是一本真实的教科书。它凝聚了共产党人的精神，谱写了中国革命闪光的篇章。 祈念曾(新闻工作者，现居深圳) 《延安，我把你追寻》是我8年前的一首诗作，没想到被选入人民教育出版社新编的第12册语文课本中。回忆这首诗的写作过程，心中再次涌起火辣辣的激情和沉甸甸的思索……。1968年，我从北京大学中文系毕业，分配到陕西工作。我曾多次到延安参观采访。当时，正是十年动乱时期，延安的面貌变化不大。1974年我到延安采访，那里的人民依然比较贫困，我心里难过极了。归来后，写一首《延安，我为你哭泣》的诗，留在我的日记本上。粉碎“四人帮”以后，拨乱反正，改革开放，延安的面貌才发生了翻天覆地的变化。延安人民丢掉了老牛破车，通了飞机、火车，窑洞变成了林立的高楼大厦，人民越来越富裕。1991年，我随中央电视台《黄河》创作组再次不定期到延安采访，参观了枣园、杨家岭、宝塔山、南泥湾等地，浮想联翩，遐思漫伸……我看到当年南泥湾开荒的镢头，在大生产运动中开垦出陕北的锦绣江南；我望着延河清澈的流水，这河水曾哺育了无数中华民族最优秀、最有觉悟的先锋战士；我闻着枣园梨花的清香，当年毛主席在这里写下了彪炳史册的革命雄文；我走进杨家岭“鲁艺”的礼堂，毛泽东那篇《在延安文艺座谈会上的讲话》又回响在我的再边。追寻当年革命前辈的足迹，我更感到今天的幸福生活来之不易。 老一辈无产阶级革命家所培育的延安精神是革命的传家宝，是中国人民宝贵的精神财富。如今，时代发展了，生活富裕了，但艰苦奋斗、开拓进取的延安精神不能丢。延安精神既体现了共产党人的高尚品质和崇高理想，又凝聚了中华民族的传统美德和英雄气概。在我们建设现代化社会主义强国的进程中，延安精神更要发扬光大，在物质生活水平不断提高的情况下，更要提高精神生活的质量。 基于这种认识，我开始构思，创作了《延安，我把你追寻》这首诗。 诗写完后，1992年，收入我的诗集《人生之恋》(陕西人民出版社)，受到文学界和广大读者的好评。评论家马莹伯撰文说：“这首诗以高昂的激情和生动的形象讴歌了延安精神，强调了改革开放条件下继承和发扬延安精神的极端重要性。”这首诗，1993年荣获全国诗歌“菊花奖”，1994年入选《新时期诗歌精选》。1997年选入5年制语文课本第10册，今后又选入6 年制语文课本第12册。 1992年，我来到深圳，虽然离开了生活工作20多年的黄土地，但延河永远在我心中流淌，融入我的血管，净化我的灵魂。祁念曾 : 1963年至1968年北京大学中文系学生，1969年至1980年陕西省宝鸡铲车厂新闻干事，1981年至1991年陕西省宝鸡教育学院副教授，1992年至1993年广东惠州晚报总编辑，1993年至1996年深圳市深圳晚报总编室主任，1996年至2002年深圳市深圳商报新闻研究室主任，高级编辑、教授。 姓 名： 祁念曾 笔 名： 祁星 性 别： 男 出生年月： 1946/12 民 族： 汉族 诗集《火红的战旗》(1975年陕西人民出版社)，诗集《春天的歌》(1982年秦岭诗丛)。诗集《人生之恋》(1991年陕西人民教育出版社)，散文集《红烛之歌》(1987年辽宁教育出版社)，《高等写作教程》(1987年上海文化出版社)，《宝鸡漫游》(1988年陕西人民美术出版社)，《千秋业》(报告文学集)(1992年中国青年出版社)，《新时期文学》(评论集)(1992年河北大学出版社)，《苏轼凤翔诗文赏析》(1990年陕西人民出版社)，《艺术家的脚步》(1997年京华出版社)，《三秦儿女在深圳》(报告文学集，1998年三秦出版社)。 [祈念曾简介]祈念曾，毕业于北京大学中文系，曾任《红旗》杂志记者，《惠州晚报》总编辑，《深圳晚报》总编室主任。现任深圳报业集团新闻研究室主任，高级编辑，中国作家协会会员，中国记协新闻研究会会员。主要著作有诗集《人生之恋》、《春天的歌》。散文通讯集《红烛之歌》、《艺术家的脚步》，长篇报告文学《千秋业》，评论集《新时期文学》、《新闻探索与实践》等，其作品和论文多次在全国和省、市获奖。其代表作《延安，我把你追寻》1997年到2003年三次被收入全国小学语文课本转载
祁念曾，出生于1946年12 月，笔名祁星，河南洛阳人，毕业于北京大学中文系。曾任《红旗》杂志社记者，陕西某高校中文系副教授，《惠州晚报》总编辑，现任深圳商报社新闻研究室主任、高级编辑、中国作家协会会员。
祁念曾，出生于1946年12月，笔名祁星，河南洛阳人，毕业于北京大学中文系，曾任《红旗》杂志社记者，中国作家协会会员、《惠州晚报》总编辑，高级编辑
祁元明发表的论文
作为一名郑大的学子，平时自然少不了和老师们打交道啦。我是一个自制力很差的人，不得不说，有些老师虽然很有才学，讲课我却是真的听不进去。但是有几位老师讲的课！即使不是他们系的学生，也值得去蹭一蹭听一听。
一、杨松华
数学系。主要是在水利与环境学院教高等数学。我大一的时候由于高数学的不好，千方百计地“潜入”他们系，蹭了那么两节课。他给我的第一印象，就是“牛”和“通俗易懂”。他上课喜欢“盲讲”，直接不用ppt。我们都知道数学是一门非常难的学科，鬼知道那些复杂的微积分公式和题型，他是怎么全记在脑子里，还保证不出错的。总而言之，去蹭一堂他的课，绝对受益匪浅。
二、王士祥
文学院的一名教授。可能大家会在电视上见到他！百家讲坛《隋唐考场风云》就是他讲的！作为一个特别喜欢古代文学的学生，我最喜欢的就是王士祥教授的《说不清的李白》论文，感觉教授一定是一个“脑洞”非常大的文科生，他让我对古代诗人有了全新的认识。即使不能去蹭他的课，也要读一读他的论文~
三、谷佳媚
马克思学院。有幸被她教过一个学期的毛概。虽然说这门课在我们眼中是个“耍课”，但是上课的时候真的忍不住专注起来。我不禁感叹，一个女教授，学识怎么会如此渊博。她可以滔滔不绝的讲下一整节大课，历史风云，旁征博引，真的是太有魅力了。
这就是我最喜欢的三位教授啦，他们的课真的值得大家一“蹭”。其实郑州大学的优秀教授还有很多，这几年的学习也让我受益匪浅。也欢迎外校的同学来郑大听课哦。
谢谢阅读，希望对你有所帮助。
学长是商学院的，对商学院的老师最为了解，给大家介绍一下商学院值得蹭课的教授。
李中建。李中建教授教的我们是《政治经济学》，第一次来给我们上课就觉得这个老师太配“仙风道骨”这四个字了。哈哈，瘦高个，细高条，这不是男神的身材嘛。李老师的教学经验十分丰富，曾多次到国外交流学习，当初是大一给我们上的课，让我这个土包子打开了眼界，原来外边的世界这么丰富，这么精彩，不出去看看真心会遗憾。《政治经济学》其实挺枯燥的，其中的原理跟我们现实世界中的不太接轨，这让我们一时难以接受。但是李老师讲的却是深入浅出，结合他的人生经历来讲，枯燥的知识点都变的有趣了。这门课自己考了90分，是学长为数不多的高分，哈哈。如果你要考郑州大学商学院的金融学硕士的话，《政治经济学》是必考的科目，所以来蹭李老师的课绝对会收获很多，学长不会你的，其中的原因，我相信你懂得。另外，李老师现在玩起了自媒体，开设了微信公众号，微信搜索“中建观社会”，马上关注！（哈哈，给老师打个广告）
李琴英。李老师是我们金融系的系主任，教过我们《保险学》。李老师完完全全的知性美，讲话十分有气质，抑扬顿挫，能把知识点讲的很明白。李老师的课堂气氛十分活跃，经常会组织小组展示PPT，找一个保险案例，让大家分小组讨论其中的责任、赔偿问题。结合实际生活中的案例让我们学习的更透彻，不局限于书本上的知识。到现在我还清楚的记得李老师说过的一句话，“中国人买保险最大的错误就是不给顶梁柱买保险，而选择给孩子买，因为一旦家里的顶梁柱出了问题，这个家就完了！”另外，李老师还是九三学社党派，对国家大事见解、认识十分独到，跟她聊天绝对会在舒服的氛围中不知不觉地提高自己。
田霖。田老师教过我们《国际支付与结算》、《国际财务管理》，因为这两门课是英文授课，老师的英文水平是真的高，跟着老师学习能学到不少的知识。田老师真心漂亮年轻，看起来就跟大学生一样，另外老师因为英语水平高，基本上会是考研复试的英语考官。
这是我的解答，希望能帮到你，欢迎互动哟。
祁同伟发表的论文
为大家收集整理了《精选法院副厅长岗位竞职演讲范文》供大家参考，希望对大家有所帮助！！！ 尊敬的 各位领导、同志们： 大家好！我感谢领导和同志们给我这次展示自我的机会，我有勇气接受领导和同志们的考查，我愿意为新的人事制度呐喊助威。 下面我分三点讲如何面对竞争。 一、我参加竞争的条件 我生于**年8月，大学文化，中共党员，**级法官，现任经济庭审判员。 我是**年从**学校毕业分配到法院的，曾在位伯法庭、办公室、政工科、经济庭工作，历任书记员、助审员、审判员职务。回顾十二年的工作，可以说随着改革的大潮，我的进步也不小。在办公室时，完成了打字油印的更新换代，我成为咱们法院第一任电脑打字员。在政工科工作时，较好地完成了人事任免、调动、工资调整的报批手续工作。到经济二庭至经一、经二合并至今，我审结百余起案件，均无过错。乡镇企业破产，在法院是一个新课题。为了完成领导交给的这项任务，我反复自学了《破产法》、《民诉法》、《乡镇企业管理条例》等相关法律法规，为乡镇企业这个支离破碎、民冤四起的破产单位划上了一个圆满的句号。十多年的努力，十多年的工作，领导和同志们看在眼里、记在心上，给了我很高的评价，我先后多次被评为先进个人。 有人说法官不学习，等于国家没有法律，这话一点也不假。因为每部新法规的颁布实施，都要看法官的掌握程度。如果法官不掌握，等于立法机关白忙活。鉴于学习的重要，我工作之余，自学了计算机、英语、法学基础理论知识。**年我考取了中国政法大学法学本科，系统学习了《合同法》、《国际经济法》等18门课程，完成了题为《论有担保的债权在破产案件中的法律适用》毕业论文，今年七月份领取了法学本科学位证和毕业证书。我还参加了法院、省法院、中院组织的《证券法》、《合同法》、《担保法》、《公司法》《票据法》等专项法律审判业务的培训。通过以上学习，使我增长了知识，拓宽了视野，为这次竞争创造了良好的条件。 二、我参加竞争的意识 竞争不是争权夺利，竞争是对自己所学知识的自省，竞争是改变旧的人事制度的催化剂，竞争是我国政治体制与世界接轨的桥梁竞争是一种责任，竞争是一种奉献，竞争是当代青年对社会的。我们有幸处于竞争的年代，应感到无此自豪。想过去，一纸委任状耽误多少人，多少能人志士在旧的人事制度压抑下不能一展雄才，误了人，误了事业，阻止了国家前进的步伐。看现在，我院1999年第一次竞争上岗，就争出了法院一个能者上、庸者下的新气象，就创出了一个规范、高效、公正的新局面。铁的事实告诉我们，岗位不要怕争，就怕争得不当，就怕争得不公平。只要能者上，庸者下，法院的工作还能更上一层。至于我个人，我相信领导，相信同志们，结果并不重要，重在参与，重在我有这种奋发向上的精神。 三、我参加竞争的 以上我曾说过，竞争是一种责任，是一种使命，一旦我竞岗成功，我绝不辱使命，我将协助正职，致力于本庭，做到三点： 1、让执法主体知识化。未来的时代，是知识的时代，资格、经验在知识面前，将变得微不足道。我们要想得到社会的认可，就必须增长知识。所以我向本庭同仁提出的第一条建议就是，长知识，就能胜任自已的工作;长知识，就能执掌自己的命运。 2、让执法环境纯净化。究以往执法过错，多都因执法环境污染而生。试问一位法官如长期生活在吃喝玩乐的腐败环境中，很难养成一身正气。所以我向本庭同仁提出的第二条建议就是，为了让自己的职业使命健康长寿，远离那些不义之道吧。 3、让执法责任具体化。一个庭就是一个家庭，没有高低贵贱之分。人与人之间只能因分工不同而得到不同行为的认可，不能因职务不同而允许歪风邪气的放肆。同志们之间遇事不推，遇利不抢，让每一位同志在不同的岗位上各尽其责，各司其职，这是我向本庭同仁说的第三点。 各位领导、全体同志们，我今天站在这里，就是为了接受你们高标准的衡量。我愿意通过这次体验，发现自己更多的不足。不论你们对我做出什么结论，都是对我的一种关心与帮助。我将在你们的建议下，不断完善自我，更好地干好自己的工作。
现任云南省教育厅厅长是周荣。
周荣，男，汉族，1962年生，云南宣威人，教授，博士生导师。历任昆明理工大学党委书记，云南省先进成形制造工程技术研究中心主任，昆明理工大学原校长。现任云南省委高校工委书记、教育厅党组书记、教育厅厅长。
研究方向：金属耐磨材料加工、半固态材料加工。
主持或参加了国家级、省部级科研项目及企业委托项目10余项，在国内外刊物上发表学术论文50余篇，其中被SCI、EI、ISPT收录论文10篇，获省科技进步奖2项科研成果“控制冷却贝氏体球墨铸铁”及“控制冷却贝氏体耐磨铸钢”实现产业化，取得了显著的经济效益。
云南省教育厅主要职责
1、拟订教育改革与发展的规划和政策，起草或拟订教育方面的地方性法规、政府规章草案及规范性文件并监督实施。
2、负责各级各类教育的统筹规划和协调管理，会同有关部门拟订各级各类学校的设置标准，指导各级各类学校的教育教学改革，负责教育基本信息的统计、分析和发布。
3、负责推进义务教育均衡发展和促进教育公平，负责义务教育的宏观指导与协调，指导普通高中教育、幼儿教育和特殊教育工作。拟订基础教育的评估标准、教学基本要求和教学基本文件，组织审定中小学省级地方课程教材，全面实施素质教育。
4、指导教育督导工作，负责组织和指导对中等及中等以下教育、扫除青壮年文盲工作的督导检查和评估验收工作，指导基础教育发展水平、质量的监测工作。
5、指导以就业为导向的职业教育的发展与改革，拟订中等职业教育教学指导文件和教学评估标准，指导中等职业教育教材建设和职业指导工作。
6、指导高等教育发展与改革，承担深化直属高等学校管理体制改革的责任。
拟订高等教育教学指导文件，统筹协调、管理高等学校专业设置和调整，会同有关部门提出高等学校设置、更名、撤销与调整的建议，负责“211工程”的实施和协调工作，统筹指导各类高等教育和继续教育，指导改进高等教育评估工作。
7、负责本部门教育经费的统筹管理，参与拟订教育经费筹措、教育拨款、教育基建投资的政策，负责统计教育经费投入情况。
8、统筹和指导少数民族教育工作，协调对少数民族和少数民族地区的教育援助。
9、指导除高等学校外各级各类学校的思想政治工作、德育工作，指导各级各类学校的体育卫生、艺术教育、国防教育工作。
10、主管教师工作，会同有关部门拟订各级各类教师资格标准并指导实施，指导教育系统人才队伍建设。
11、负责各类高等、中等学历教育招生、考试和各类高等学历教育学籍学历管理工作，会同有关部门拟订高等学校招生计划，实施国家学位制度。负责中等专业学校设立审批。参与拟订普通高等学校、中等专业学校毕业生就业政策，指导普通高等学校、中等专业学校开展毕业生就业创业工作。
12、规划、指导高等学校的自然科学和哲学、社会科学研究，协调、指导高等学校参与国家、省创新体系建设和承担国家、省科技重大专项等各类科技计划的实施工作，指导高等学校科技创新平台的发展建设，指导教育信息化和产学研结合等工作。
13、统筹管理并协调教育系统的外事工作，拟订出国留学、来华留学、中外合作办学等方面的政策。规划、指导、协调汉语国际推广工作，开展与港澳台的教育合作与交流。
14、拟订语言文字工作政策和中长期规划，组织实施汉语和少数民族语言文字规范和标准。指导推广普通话工作和普通话师资培训工作。
15、负责推进高等学校后勤社会化改革工作，指导各级各类学校勤工俭学和贫困学生资助工作。指导教育系统的治安环境综合整治和突发事件处置。
16、承办云南省人民政府交办的其他事项。
以上内容参考：
百度百科-周荣
云南省教育厅-中共云南省委教育工委主要职责
丁锋论文发表
1. 张雷,李东来,马锐强,奚长海,万冬梅*.人工巢箱繁殖鸟类主要巢捕食者及其影响因素研究. 生态学报,2013, DOI号：10.5846/stxb2012101514312. Dongmei Wan*, Peng Chang, Jiangxia Yin. Causes of extra-pair paternity and its inter-specific variation in socially monogamous birds. Acta Ecologica Sinica(International Journal),2013,33:158-1663. 尹黎献,张雷,常鹏,李静,万冬梅*.大山雀的婚外父权调查.动物学研究,2013,34(1):47-52.4. 李乐,张雷,殷江霞,刘子成,刘鹤,万冬梅*.人工巢箱条件下两种山雀鸟类的同域共存机制.生态学报,2013,33(1):0150-0158.5. 李静,殷江霞,尹黎献,李乐,常鹏,万冬梅*.杂色山雀亲代喂食与子代乞食间的行为交流.动物学杂志,2012,47(4):19-27.6. 李乐,万冬梅*,刘鹤,殷江霞,李其久,霍雅鹏.人工巢箱条件下杂色山雀的巢位选择及其对繁殖成功率的影响.生态学报,2011,31(24):7492-7499.7. 杜杨,霍雅鹏,万冬梅*,孙军,吕永通,曹君.杂色山雀对人工巢箱内苔藓类巢材的选择.动物学杂志,2010,45(4):144-149.8. YUN-LEI JIANG, WEI GAO, FU-MIN LEI, DONG-MEI WAN, JIANG ZHAO and HAI-TAO WANG*.Nesting biology and population dynamics of Jankowski’s Bunting Emberiza jankowskii in Western Jilin,China. Bird Conservation International,2008,18:153–163.9. 金春日,王爽,万冬梅*,李昊晔,曲再春,丁锋. 杂色山雀繁殖成功率的研究.动物学杂志,2007,42(3):28-33.10. 金春日,王爽,万冬梅*,李昊晔,霍雅鹏. 杂色山雀繁殖生态.生态学杂志,2007,26(12):1988－1995.11. 赵匠，万冬梅，王海涛，高玮. 大鸨繁殖期觅食地的选择. 应用生态学报，2005，16（3）：501-50412. 万冬梅，赵匠，高玮，王海涛等. 大鸨求偶场的选择. 生态学报，2004，24（11）：2597-2601.13. 赵匠，高玮，万冬梅，王海涛等. 大鸨繁殖期活动时间预算和日节律. 应用生态学报，2003，14（10）：1705~1709.14. 王海涛，高玮，万冬梅，刘多，邓文洪. 利用天然树洞繁殖的五种鸟的巢位特征及繁殖成功率. 生态学报，2003，23（7）：1377~1385.15. 万冬梅，高玮，赵匠等. 大鸨巢位选择研究. 应用生态学报，2002，13（11）：1445~1448.16. 万冬梅，高玮，王秋雨，王海涛. 生境破碎化对丹顶鹤巢位选择的影响. 应用生态学报，2002，13（5）：581~584.17. 万冬梅，高玮，赵匠，王海涛. 辽宁猛禽迁徙规律的研究. 东北师大学报，2002，34（2）：78~83.18. 万冬梅,任炳忠,张凤岭.吉林省鸣蝗属一新种.动物分类学报,1998,23(1):33~35.
张锋发表论文
“诺奖风向标”拉斯克奖揭晓， 光遗传学领域的三位科学家获2021年的拉斯克奖基础医学研究奖 | 图源：laskerfoundation.org
导 读
北京时间9月25日零点，2021年拉斯克奖（The Lasker Awards）公布了三大奖项获奖名单。其中， 基础医学研究奖 由Dieter Oesterhelt、Peter Hegemann 和Karl Deisseroth获得，以表彰他们对光遗传学的贡献；来自BioNTech的Katalin Karikó和宾夕法尼亚大学的Drew Weissman获得 临床医学研究奖 ，以表彰他们发现基于mRNA修饰的新治疗技术； 医学科学特别成就奖 则颁给了诺贝尔奖得主David Baltimore。
光遗传学被认为是一项注定要得诺奖的技术（相关文章：光遗传学：一项注定要得诺贝尔奖的技术）。
实际上，对于光遗传学技术作出贡献的科学家不止这三人，还有他们的合作者和其他科学家。
科学的发展常常伴随着科学家竞争，这是科学的常态。每一项科学成果的背后，故事主角们都有不同的悲喜。但无论结局如何，每一位 探索 在知识边缘的科学家都值得我们深深的敬意。
撰文 王承志 梁希同 林岑
责编 夏志坚 陈晓雪
北京时间2021年9月25日零点，有 “诺奖风向标” 之称的拉斯克奖 （the Lasker Awards） 公布，三位在光遗传学领域作出重要贡献的科学家获得阿尔伯特·拉斯克基础医学研究奖。
获奖理由：
发现了可以激活或沉默单个脑细胞的光敏微生物蛋白，并将其用于开发光遗传学——神经科学领域的一项革命性技术。
根据拉斯克奖官网介绍，三位获奖人的具体贡献分别是：
迪特尔·奥斯特黑尔特 （Dieter Oesterhelt） ，发现了一种古细菌蛋白质，它可以在光照条件下将质子泵出细胞；
彼得·黑格曼 （Peter Hegemann） ，在单细胞藻类中发现了相关的通道蛋白；
卡尔·代塞尔罗思 （Karl Deisseroth） ，利用这些分子创建了光触发系统，这些系统可以在活的、自由移动的动物身上使用，以理解在迷宫一般的脑回路中特定类别乃至一类神经元的作用。
大脑是人最复杂的器官，人的感觉、记忆、思考、运动等诸多生理活动，以及各种神经系统疾病都与神经元的功能息息相关。多年以来，理解各种神经元的具体功能一直是神经生物学的中心研究领域。
特异性地控制神经元活动对神经生物学家具有无法抵挡的吸引力。如果能特异性地激活一类神经元，那么就可以通过观察激活后的生理现象来推测其功能。同理，如果能特异性地抑制一类神经元，则可以推测这类神经元对哪些生理活动是必须的。
神经生物学家们尝试过各种方法来达到这个目标。比如，用微电极来刺激神经元，或者使用化学物质来模拟或者拮抗神经递质。但这些方法都有难以克服的缺陷：微电极控制的精度不够，比如不能特异性地控制一类神经元；化学物质控制神经元的速度难以控制，很难在毫秒级别进行操作。
紫色的膜与光传感器
1969 年，29岁的青年化学家迪特尔·奥斯特黑尔特 （Dieter Oesterhelt，1940年-） 从德国慕尼黑大学学术休假，来到了美国加州大学旧金山分校电子显微镜专家沃尔瑟·斯托克尼乌斯 （Walther Stoeckenius，1921年7月3日-2013年8月12日） 的实验室。
当时，斯托克尼乌斯正在研究一种可以在高盐环境中生存的古细菌的细胞膜，这种微生物现在被称作盐生盐杆菌 （ Halobacterium salinurum ） 。在这次合作中，奥斯特黑尔特证实盐生盐杆菌的细胞膜中紫色的组分含有视黄醛。随后，他和斯托克尼乌斯确定了古细菌中的一种蛋白质，并将其命名为细菌视紫红质 （bacteriorhodopsin） 。1971 年，他们提出细菌视紫红质起到了光传感器或光感受器的作用。
迪特尔·奥斯特黑尔特 | 图源：biochem.mpg
回到德国后，奥斯特黑尔特和斯托克尼乌斯继续合作这一研究。奥斯特黑尔特发现，细菌视紫红质可以将质子泵出细胞。这个神奇蛋白质，像是一个微型光能发电机，能吸收光子的能量，用这些能量把质子泵到细胞的外面，从而进一步转化为细菌所需的能量。
后来，科学家们发现了另外一种含视黄醛的光激活泵——卤化视紫红质 （halorhodpsin） ，可以将氯离子输送到细胞中。这两种物质的发现和对其生物物理、结构和遗传学的研究，为光遗传学的发展提供了基础性的见解。
来自微生物的光敏蛋白
20世纪80年代，彼得·黑格曼在位于慕尼黑的马克思·普朗克生物化学研究所攻读博士学位。他的导师正是发现细菌视紫红质的迪特尔·奥斯特黑尔特。
黑格曼的博士论文，研究的是来自另一种细菌的视紫红质——卤化视紫红质 （halorhodopsin） 。
卤化视紫红质存在于一种耐盐古细菌中，其利用光能将其生活的高盐度环境中的氯离子排出体外。黑格曼首先通过生物化学技术分离提纯了这一蛋白。
彼得·黑格曼 | 图源：project-stardust.eu
此时，刚刚在法兰克福的马克思·普朗克生物物理研究所建立自己实验室的恩斯特·班贝格 （Ernst Bamberg） 参与了进来，他通过构建体外系统来研究黑格曼所提纯出的halorhodopsin的电化学特性。
1984年获得博士学位后，黑格曼来到美国雪城大学的肯·福斯特 （Kenneth Foster） 的实验室从事博士后研究。
福斯特研究的是另一种对光敏感的微生物：单细胞绿藻。这些单细胞的藻类具有趋光性，能够挥舞鞭毛向着有光的方向游去 （它们需要光进行光合作用） 。福斯特认为，单细胞绿藻也可能使用某种视紫红质作为它们的眼睛，从而得知光亮的方向，并且能驱动鞭毛游往有光的地方。
莱茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii
1986年，黑格曼回到普朗克生物化学研究所建立起自己的实验室，开始潜心研究莱茵衣藻 （ Chlamydomonas reinhardtii ，一种微小的绿藻） 趋光性行为。
1991年，黑格曼发现，莱茵衣藻的光受体也是一种视紫红质，但它的工作方式与之前发现的各种视紫红质都不一样。衣藻视紫红质的光照之后会引起钙离子流入细胞中，从而引起的电流能够激发鞭毛的运动，他称之为光电流 （photocurrent） 。
恩斯特·班贝格（Ernst Bamberg）
人眼中的视紫红质感光之后也会产生光电流，通过神经传递到大脑之后就形成了视觉。人眼中视紫红质引起光电流需要经过细胞内一系列蛋白的信号传导，而黑格曼发现衣藻视紫红质产生光电流的速度比人眼中的视紫红质快得多。据此他大胆地推测： 衣藻视紫红质本身可能就是一个可以作为电流开关的离子通道。
然而，此后的十年里，黑格曼使尽各种办法，也无法像当初分离提纯一样分离卤化视紫红质提纯出衣藻视紫红质，来验证他的猜想。
随着分子生物的发展，2001年，黑格曼和其他科学家通过测序衣藻的基因组发现了两个新的光受体基因。
为了证明它们究竟是不是苦苦追寻十余年的衣藻视紫红质，黑格曼找到了当初和合作研究卤化视紫红质电化学特性的班贝格。
此时的班贝格已经是普朗克生物物理研究所的所长。此前的1995年，班贝格就和普朗克生物物理研究所的科学家格奥尔格·纳格尔 （Georg Nagel） 将细菌视紫红质表达在动物细胞中，使得动物细胞在受到光照时产生光电流。
奥尔格·纳格尔（Georg Nagel）
2003年，从黑格曼那里得到光受体基因后，班贝格和纳格尔用同样的方法成功地在动物细胞中表达了衣藻视紫红质蛋白，从而发现只要有这个蛋白单独存在，就能产生光电流，使阳离子流入细胞中，造成细胞去去极化。他们的结果终于证明黑格曼的假说：衣藻视紫红质是一个能被光所打开的阳离子通道。
从前人们知道，特定的化学分子，或者电压的变化，或者机械力的变化可以开关特定的离子通道，而能被光直接控制的离子通道还是第一次被发现，于是他们把衣藻视紫红质命名为视紫红质通道蛋白 （Channelrhodopsins，ChR1） 。这个词由离子通道 （Channel） 和视紫红质 （Rhodopsin） 组合而成。
他们还在爪蟾的卵细胞中表达了这种蛋白，发现光照可以引起细胞的静息电位发生变化。这项开创性的工作发表在了2002年6月的 Science 上。
2003年，纳格尔和黑格曼又发现了一个新的通道蛋白——ChR2。这一次，他们不但做了更深入的机制研究，而且把ChR2首次在人的细胞（HEK）中表达。作者在文章结论中写道：“ChR2能够成为控制细胞内钙离子浓度或者细胞膜极化水平的有用工具，特别是在哺乳动物细胞中”。
ChR1和ChR2的发现，让一些神经生物学家眼前一亮——这或许就是使用光来控制神经元的理想介质。而光遗传学的大门从这里也正式开启了。
光遗传学的诞生
视紫红质通道蛋白的发现，不仅仅解释的衣藻的趋光性行为，纳格尔和班贝格的实验还证明了这个来自衣藻的光敏感通道能独自驱使动物细胞产生光电流。因此，借助这个光敏感通道，就可以通过光来遥控动物细胞，特别是神经细胞的电活动。
用光来改变神经细胞的电活动是神经科学家长久以来的梦想，光刺激有着比传统药物刺激和电刺激更高的时间和空间的精确性，并且对组织的伤害更小。
20世纪90年代，科学家开始使用光控释放神经递质来激活细胞，但这种方法的时间和空间的精确性仍然不够。
2002年，奥地利神经科学家格罗·米森伯克 (Gero Miesenböck） 开始在光控中引入遗传学，尝试将果蝇眼中的视紫红质表达在哺乳动物细胞中，或者将哺乳动物的离子通道表达的果蝇的神经细胞中。使用遗传学的优势在于，可以专门针对研究者想到测试的神经细胞进行遥控，但米森伯克缺乏一种强有力的工具可以让光精确地改变神经活动。
格罗·米森伯克 (Gero Miesenböck) | 图源：cncb.ox.ac.uk
2003年在衣藻中发现的视紫红质通道蛋白正好提供了这样一个强有力的工具。
2000年，爱德华·博伊登 （Edward S. Boyden，1979-） 来到斯坦福大学，在钱永佑 （Richard Tsien，钱永健的哥哥） 和詹妮弗·雷蒙德 （Jennifer Raymond） 教授的指导下，研究小脑神经回路。
在钱永佑的实验室，博伊登遇到了钱永佑之前的博士生卡尔·代塞尔罗思 （Karl Deisseroth，1971-） 。代塞尔罗思之前在斯坦福大学学习神经生物学，并在斯坦福医院当过精神科住院医师。
有着工程背景的博伊登和医学背景的代塞尔罗思经常在一起讨论当时神经生理学的研究技术。多次的思想碰撞让两位年轻人意识到，当时的技术还有很大局限，神经生物学家需要更好的工具来控制大脑中特异的神经元，他们决定开发这样的工具。
Edward S. Boyden | 图源：mcgovern.mit.edu
他们最初设想可以使用磁场来控制神经元，在神经元中表达机械拉力敏感的离子通道，然后把微小的磁珠特异性连接到这种通道蛋白上，这样就可能通过外部磁场来控制神经元的电活动。但是，无论是找到合适的机械敏感离子通道基因还是把磁珠连接到通道蛋白上，技术难度都非常大。
后来，博伊登在阅读一篇1999年发表的论文中得到了灵感。这篇论文报道了在嗜盐碱单胞菌中发现的卤化视紫红质 （halorhodopsin） ，能够在大脑的氯离子浓度下工作。这种视紫红质可以在受光照时激活离子通道。
博伊登意识到使用光来控制离子通道比磁场更容易实现。他写邮件给这篇论文的作者，索要了这个蛋白的基因。但后来由于博伊登忙于博士学位论文，这件事情被晾在了一边。
2003年秋天，代塞尔罗思即将独立成为PI，组建自己的实验室。他写邮件给博伊登，希望博伊登博士毕业后可以去他的实验室做博后，一起开展之前讨论的使用磁场控制神经元的项目。
卡尔·代塞尔罗思 | 图源：
从2003年10月到2004年2月，代塞尔罗思和博伊登为即将开始的磁控神经元项目阅读了大量的文献。恰在此时，纳格尔、黑格曼和班贝格及同事们在 PNAS 期刊上发表了前文提到的ChR2的论文。
博伊登阅读这篇论文时立刻意识到，ChR2拥有他们设想过的一切特性：在一个蛋白中把输入信号 （光） 和输出 （去极化神经细胞） 偶联起来。事实上，同时意识到这一ChR2这一特性可以用于光控神经细胞的，远不止博伊登一人。
博伊登写信给代塞尔罗思，希望能联系纳格尔索要ChR2的克隆。代塞尔罗思于2004年3月联系了纳格尔。那时，纳格尔已对ChR2做了一些改良，他把这些改良后的克隆寄送给了代塞尔罗思和博伊登。
博伊登当时还在钱永佑的实验室做博士课题。但从2004年7月开始，博伊登几乎把博士课题放在了一边，专心做起了ChR2在神经元中表达的项目。
2004年8月4日的凌晨1点，博伊登在钱永佑的实验室里用蓝光照射表达了ChR2的神经元，成功观察到了去极化和动作电位。早上，他发邮件给代塞尔罗思告诉了他的发现。代塞尔罗思回信：“太棒了！！！！！” 五个感叹号显示了他当时的兴奋心情。
2005年初，张锋 （就是后来最早在哺乳动物细胞中使用CRISPR做基因编辑的那位，现麻省理工学院教授） 来到代塞尔罗思实验室开始了研究生生涯。他改进了博伊登的表达体系，使用慢病毒在神经元中表达ChR2，大大增加了该系统的稳定性。
2005年4月19日，博伊登和代塞尔罗思把他们的发现投稿给 Science 杂志，遭拒稿，理由是没有具体的科学发现。5月5日，他们投稿到 Nature 杂志， Nature 建议把稿件转投给 Nature Neuroscience 杂志。经过一轮修改， Nature Neuroscience 接受了这篇文章。
光遗传学的其他研究者
自从黑格曼等在2003年发表了光敏通道蛋白ChR1和ChR2，很多科学家都意识到这类光控通道蛋白有极大的应用潜力。一场无形的竞争也在悄然展开。
美国底特律的韦恩州立大学华人神经科学家潘卓华是一位视觉专家，他在2000年早期即构想将光敏蛋白表达在盲人的眼内，以代替视杆细胞和视锥细胞的缺失。
潘卓华 | 图源：kresgeeye.org
2003年ChR1和ChR2论文的发表，潘卓华敏锐地觉察到这可能就是他一直在寻找的光敏蛋白。
他与萨鲁斯大学 （Salus University） 的 Alexander Dizhoor 教授合作，在神经节细胞中表达ChR2。Dizhoor 教授的团队设计合成了光敏通道蛋白的DNA，并添加了示踪的荧光蛋白——这与纳格尔对ChR2的改良非常类似。同时，潘卓华使用病毒在细胞中表达ChR2，这与张锋在代塞尔罗思实验室的改进也相似。
2004年7月，潘卓华将载有ChR2基因的病毒注入给小鼠，5周后他通过荧光蛋白确认了ChR2在视网膜细胞上的表达。当他打开照射灯时，插入视网膜的电极显示了明显的电活性。这显然是个了不起的实验，它第一次证明了ChR2在活体动物中的活性，证明表达视紫红质通道蛋白可以使的失明的大鼠重新感光——这有着极大的应用价值，有可能成为治愈盲人的一种方法。
2004年11月25日，潘卓华和合作者将这些发现投稿给 Nature 杂志。与代塞尔罗思的文章遭遇一样， Nature 建议将文章改投到旗下子刊 Nature Neuroscience 。
不过，潘卓华的论文继续被拒。2005年初，潘卓华将文章投到 Journal of Neuroscience ，再次遭拒稿。
2005年5月，潘卓华在佛罗里达参加视觉与眼科学研究协会大会时，简短报告了他的这项成果。当时他的论文还没有发表，这是该工作第一次公布于众。
2005年，日本的 Hiromo Yawo 实验室和美国的凯斯西储大学的林恩·兰德梅赛 （Lynn Landmesser） 和 Stefan Herlitze 也发表了类似的结果，他们比代塞尔罗思等人等的文章晚了两三个月。
科学的发展常常伴随着科学家竞争，这是科学的常态。每一项科学成果的背后，故事主角们都有不同的悲喜。但无论结局如何，每一位 探索 在知识边缘的科学家都值得我们深深的敬意。
光照使表达了Channelrhodopsin的神经元放电
光遗传学的发明，几乎在一夜之间改变了神经科学研究。
从线虫到灵长类动物，人们在几乎所有实验动物中表达光敏感通道来实现远程遥控神经活动。通过在不同类型的神经细胞中表达光敏感通道，人们可以用光控制小鼠的行为，控制它们的运动，使它们产生虚拟的饥饿感或饱腹感，甚至在它们脑中用光写入或抹去特定的记忆。
光遗传学已经成为神经科学中证明因果性的关键手段。这一技术也为众多医学应用开辟了道路。科学家们希望能利用光，给盲人提供基本视力，刺激患有帕金森病的患者的深部脑，甚至影响心律，以治疗心力衰竭。
用光纤控制实验鼠的行为
作为一项彻底改革了神经科学发展的技术，光遗传学也让包括黑格曼、纳格尔、班贝格、代塞尔罗思、博伊登在内的科学家在过去几年中屡获殊荣，其中包括了2010年《科学》杂志十年最佳进展，2013年的大脑奖，2015年的生命科学突破奖、2016年度科学突破奖、2019年的拉姆福德奖金和2020年的邵逸夫奖等。
回到故事最开始的时候，科学家们只是想知道单细胞藻类微小的秘密。彼时，没有人会想到，那些努力向光游去的小绿藻，最终居然教会我们如何改写大脑活动的秘诀，推动我们向解开大脑秘密前进了一大步。
迪特尔·奥斯特黑尔特
现为德国马克斯·普朗克生物化学研究所名誉组长。他1940年11月10日出生于德国慕尼黑，1959-1963年在德国慕尼黑大学学习化学，1967年他博士毕业于慕尼黑大学，之后担任马克斯·普朗克细胞化学研究所研究助理。1969年，奥斯特黑尔特前往加州大学旧金山分校做研究，并在那里开启了对细菌视紫红质的研究。1973-1975年，他是马克斯·普朗克学会弗里德里希·米歇尔实验室的研究组长，1976-1979年在维尔茨堡大学任正教授。1980年之后，奥斯特黑尔特长期担任马克斯·普朗克生物化学研究所所长。2008年退休。
彼得·黑格曼
1954年12月11日出生于德国明斯特。1975年至1980年在明斯特大学和慕尼黑大学学习化学。1980年至1984年在马克斯·普朗克生物化学研究所 Dieter Oesterhelt 教授的指导下完成博士学位，研究细菌的光敏感离子泵。之后，在美国雪城大学的Kenneth Foster 实验室从事博士后工作，开始研究单细胞藻类的趋光行为。
1986年黑格曼回到马克斯·普朗克生物化学研究所建立微藻光受体实验室。1991年发现衣藻的光电流。2002年找到介导衣藻光电流的基因，即视紫红质通道蛋白（Channelrhodopsins）。2005年至今，在柏林洪堡大学担任生物物理学教授和系主任。
卡尔·代塞尔罗思
代塞尔罗思为美国斯坦福大学教授。他1971年出生于美国，在哈佛大学获得生物化学学士学位后，1998年在斯坦福大学获得神经学博士学位。2004年，他在斯坦福大学建立自己的实验室。
2005年，代塞尔罗思和博士后爱德华·博伊登（Edward Boyden）、学生张锋等共同发表了一篇论文，首次利用通道视紫红质在神经细胞上实现了毫秒级动作电位的控制。2006年，代塞尔罗思将这种方法命名为“光遗传学”。他们的方法很快被广泛应用于生物学各个领域，使生物学家可以用光控制各种生命活动。
主要参考资料
[1] Bamberg, Ernst, Peter Hegemann, and Dieter Oesterhelt. "The chromoprotein of halorhodopsin is the light-driven electrogenic chloride pump in Halobacterium halobium." Biochemistry 23, no. 25 (1984): 6216-6221.
[2] Harz, Hartmann, and Peter Hegemann. "Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas." Nature 351, no. 6326 (1991): 489-491.
[3] Nagel, Georg, Bettina Möckel, Georg Büldt, and Ernst Bamberg. "Functional expression of bacteriorhodopsin in oocytes allows direct measurement of voltage dependence of light induced H+ pumping." FEBS letters 377, no. 2 (1995): 263-266.
[4] Nagel, Georg, Doris Ollig, Markus Fuhrmann, Suneel Kateriya, Anna Maria Musti, Ernst Bamberg, and Peter Hegemann. "Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae." Science 296, no. 5577 (2002): 2395-2398.
[5] Boyden, Edward S., Feng Zhang, Ernst Bamberg, Georg Nagel, and Karl Deisseroth. "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity." Nature neuroscience 8, no. 9 (2005): 1263-1268.
[6]Zemelman, Boris V., Georgia A. Lee, Minna Ng, and Gero Miesenböck. "Selective photostimulation of genetically chARGed neurons." Neuron 33, no. 1 (2002): 15-22.
[7]Nagel, Georg, Tanjef Szellas, Wolfram Huhn, Suneel Kateriya, Nona Adeishvili, Peter Berthold, Doris Ollig, Peter Hegemann, and Ernst Bamberg. "Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel." Proceedings of the National Academy of Sciences 100, no. 24 (2003): 13940-13945.
[8]Boyden, Edward S. "A history of optogenetics: the development of tools for controlling brain circuits with light." F1000 biology reports 3 (2011).
[9]Bi, Anding, Jinjuan Cui, Yu-Ping Ma, Elena Olshevskaya, Mingliang Pu, Alexander M. Dizhoor, and Zhuo-Hua Pan. "Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration." Neuron 50, no. 1 (2006): 23-33.
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](
张锋教授简介 张锋，教授，男，1961年9月23日生，理学博士。1982年辽宁大学化学系有机专业大学毕业，理学学士。1985年辽宁大学化学系无机专业博士研究生毕业，理学硕士。1998年日本名古屋大学理学部生物无机化学专业博士研究生毕业，理学博士。1985-1993年在辽宁大学化学系任教，1985-1987年任助教，1987年晋升讲师，1993年晋升副教授。1992年9月-1993年9月在北京语言学院出国部参加国家教委日语培训班并通过选拔考试。1993-1994年国家教委公派赴日留学，在日本名古屋大学理学部化学科生物无机化学研究室做访问学。1994-1998年在日本名古屋大学研究生院攻读博士学位。1998年3月获博士学位后回国。1998年3月至今在辽宁大学化学科学与工程学院任教。1999年8月晋升教授。