马腺疫(Strangles)是由马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp.equi，S.equi )引起的马属动物表现发热、上呼吸道卡他、下颌淋巴结和咽后淋巴结脓肿的传染病[1-2]，该病仍危害着世界养马业的发展，造成严重经济损失。灭活和弱毒马腺疫疫苗的免疫效果均不理想[3-4]，不能有效防止该病的发生，且有较多的副反应，SeM (Streptococcus equi subsp.equi M-like protein)为该菌重要的毒力因子和免疫原，该蛋白质还可参与该菌的免疫逃避[5]，目前认为以SeM蛋白为抗原制成的疫苗免疫马匹效果不理想，产生的抗体持续时间较短，需进行多次免疫[6]，国外使用的7种蛋白质组分的亚单位疫苗虽然安全有效，但成本高，有必要研发更加安全、经济、有效的新型马腺疫疫苗。研究表明，仅有抗体参与的免疫在其抗感染过程中是不够的，还需要黏膜免疫及先天性免疫的参与。当前被广泛使用的铝胶佐剂虽能引起强烈的体液反应，但是却不能触发细胞免疫应答和黏膜免疫应答。

研究表明，鞭毛蛋白不仅具有较强的免疫原性[7-10]，还具有良好且独特的免疫增强特性，不但可以启动和促进针对外源抗原的细胞免疫和黏膜免疫[11-12]，还可通过与多种细胞表面的TLR5结合上调细胞因子的表达，有效诱导宿主获得性免疫应答[13]，该特点使得鞭毛蛋白在改善SeM的免疫效果方面具有良好的利用和开发潜力。

本栏目主要刊载反映医学影像领域研究进展及学术动态的研究论文。按不同的论文格式和内容分为论著、技术应用、临床观察、影像诊断、实验研究、病例报告、综述等子栏目。

虽然有关鞭毛蛋白的免疫增强作用已在多种疫苗中得到了证实，如FMDV[14]、NDV[15]、AIV[16]、金黄色葡萄球菌[17]等，但报道的鞭毛蛋白多是有关鼠伤寒沙门菌的，有关马流产沙门菌鞭毛蛋白的研究及其对马腺疫SeM蛋白免疫效果的影响也未见报道。本研究表达纯化了马流产沙门菌的FliC蛋白，将纯化的FliC蛋白与本室以往构建表达的马腺疫链球菌的SeM蛋白[18]联合免疫小鼠，检验该鞭毛蛋白FliC对SeM的免疫效果的影响，以期为新型马腺疫疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

18～22 g雌性6～7周龄C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，马链球菌马亚种分离株XZ1由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室分离鉴定并保存。原核表达载体pGEX-4T-2及含重组质粒pET28a-FliC和pGEX-SeM的大肠杆菌BL21(DE3)均由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室构建并保存提供。

采用间接ELISA法[20]测定重组蛋白质免疫前、一免及二免后的抗体水平。用100 μL的重组蛋白FliC、SeM和FliC+SeM分别作包被抗原，100 ng·孔-1 4 ℃过夜包被，次日PBST洗涤5次后37 ℃封闭2 h，加入1∶300倍稀释的待检血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次后加入100 μL 1∶6 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG作为二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗涤5次后，TMB溶液显色15 min，测OD450nm值。将二免后的血清做3倍梯度稀释，37 ℃封闭2 h后PBST洗5遍，加入100 μL梯度稀释待检血清为一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次加入1∶6 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG 100 μL作为二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗涤5次，加入TMB显色15 min，测OD450nm值。

1.2 重组蛋白质的表达及纯化

将表达载体pGEX-4T-2和含重组质粒pET-28a-FliC、pGEX-SeM的大肠杆菌BL21(DE3)[18-19]，在37 ℃ 200 r·min-1振荡培养至OD600 nm达到0.4，加入终浓度为1 mmol·L-1 IPTG诱导表达4 h。收集菌体，经超声破碎后，用15% SDS-PAGE电泳，利用亲和柱层析法对收集的上清液进行纯化。

1.3 重组蛋白质的Western blot鉴定

数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析one-way ANOVA q检验进行差异性比较，以P<0.05表示差异显著，用不同小写字母表示；以P<0.01表示差异极显著，用不同大写字母表示。

1.4 小鼠免疫试验

(2)通过查询映射服务器MS，入口隧道ITR获得地址标识RLOC2，该标识与身份标识EID2相对应，由此一来，就建立了出口隧道路由器ETR将LISP之间的隧道通信。此时，入口隧道路由器ITR的端口地址是其隧道IP地址源地址，即RLOC2，出口隧道路由器RLOC2是目的地址。在确定源地址和目的地址之后，将源地址和目的地址分别是EID1和EID2的IP数据封装成数据包，由ITR向ETR发送该数据包[2]。

分别以FliC+SeM、FliC及SeM为包被抗原对免疫小鼠血清中IgG亚型检测，结果显示以IgG1抗体为主的免疫应答，且FliC+SeM联合免疫组的IgG1抗体水平极显著高于SeM单独免疫组(图4)。

中等分子量蛋白Marker购自大连宝生物工程有限公司；HRP-IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TMB及 DAB显色液购自北京索莱宝科技有限公司；其他相关化学试剂均为国产分析纯。

用100 μL重组蛋白FliC、SeM和FliC+SeM(100 ng·孔-1)分别4 ℃过夜包被ELISA板，封闭1 h，加入100 μL 1∶300的待检血清，PBST洗涤5次后以1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG1、IgG2a分别作为二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次后TMB显色15 min，测OD450nm值。

挑取马链球菌马亚种XZ1株单菌落接种于TH培养基中37 ℃培养，在二次免疫后30 d进行攻毒，攻毒途径均为腹腔注射，攻毒剂量为 4×108CFU·mL-1，攻毒后72 h内连续观察小鼠精神状态及饮食欲并记录小鼠死亡情况。

将纯化的重组蛋白SeM、FliC和GST标签蛋白按1∶1与弗氏佐剂乳化。SPF级18～22 g的雌性C57BL/6小鼠55只随机分为5组，每组11只。分别设PBS对照组、GST对照组、重组蛋白FliC和SeM联合免疫组、SeM免疫组、重组蛋白FliC免疫组，乳化后的抗原经皮下多点注射小鼠，免疫剂量均为50 μg·只-1，2周后免疫第二次，共免疫2次。第一次免疫后14 d及第二次免疫后21 d对免疫小鼠进行尾静脉采血，收集血清于-20 ℃保存。

1.5 统计学分析

将纯化后的重组蛋白质FliC经SDS-PAGE电泳后，湿法电转移至硝酸纤维素膜上(300 mA，1 h)，于5%的脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜，以马流产沙门菌阳性血清为一抗(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜后以HRP标记的兔抗马IgG(1∶5 000)为二抗，37 ℃孵育45 min，洗涤3次后，DAB显色。重组蛋白 SeM 的Western blot 鉴定方法见文献[18]。

2 结 果

2.1 重组蛋白质的表达及纯化

重组蛋白质经SDS-PAGE电泳分析显示，SeM蛋白可在预期66 ku附近出现一条明显的目的蛋白质条带(图1a)，FliC蛋白可在预期的52 ku处出现一条明显的目的蛋白质条带(图1b)，GST标签蛋白可在预期的26 ku处出现一条明显的蛋白质条带，表明得到了较高纯度的重组蛋白SeM和FliC和GST标签蛋白。

a. SeM的表达及纯化；b. FliC的表达及纯化；c. GST的表达及纯化；M. 低相对分子质量标准；1、2. 纯化后重组蛋白质；3.超声上清；4. 诱导后SeM表达产物；5. 诱导前SeM表达产物；6.超声上清；7.超声沉淀；8、9. 纯化后FliC重组蛋白；10. 空载体对照超声上清；11. 空载体对照超声沉淀；12、13. 纯化后空载体对照的GST标签蛋白 a.The expressed and purified protein SeM; b. The expressed and purified protein FliC; c. The expressed and purified protein GST; M. The low protein molecular weight marker; 1, 2. Purified recombinant SeM protein; 3. Supernatant after ultrasonic disruption; 4. Expressed SeM products; 5. SeM expression before induction; 6. Supernatant after ultrasonic disruption; 7. Pellets after ultrasonic disruption; 8, 9. Purified recombinant protein; 10. Supernatant after ultrasonic disruption of GST; 11. Pellets after ultrasonic disruption;12 and 13. Purified recombinant protein 图1 SDS-PAGE分析SeM、FliC、GST的表达 Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression of the SeM, FliC, GST proteins

2.2 重组蛋白FliC的Western blot分析

Western blot结果鉴定，纯化的重组蛋白FliC能与马流产沙门菌阳性血清发生特异性结合，在52 ku处出现明显特异性条带，表明该重组蛋白表达成功且具有良好的反应原性(图2)。

2.3 免疫小鼠血清抗体的检测

间接ELISA检测结果显示，各免疫组在免疫后抗体水平与对照组相比均有明显升高，随着免疫时

终于睁开眼了。啪，立刻有东西打在脸上，把我打得又闭上了眼。再睁开，就看见明亮的日光灯下，李老黑的闺女李金枝杏眼圆睁怒不可遏，手里握着本花花绿绿的杂志，作势又要朝我打过来。我两手护住脸说，等等，这是咋的了，你凭什么打人？

间推移，抗体水平持续上升(图3)。分别以FliC+SeM、FliC及SeM作为包被抗原检测时，FliC+SeM联合免疫组在免疫后14和35 d的抗体水平均极显著高于SeM单独免疫组及对照组(图3)。

（1）象形字的教学。如在进行象形字的教学时，教师可采用直观教学法，将汉字的演变过程通过图片或者视频的形式予以呈现。例如：在教“日”、“月”时，可将太阳和月亮的图片展示给学生。

马腺疫传播迅速，在世界范围内发病比较普遍。随着新疆马产业的快速发展，马腺疫疾病的发病率和死亡率不断升高。该病不仅严重影响了马驹的正常发育，且已成为马驹死亡的主要原因[21]。对该病的预防控制主要是使用疫苗，目前常规疫苗存在一定隐患，如毒力返强和灭活不彻底带来的危害等。目前除了常规疫苗外，亚单位疫苗是被接受的一个有效的免疫预防手段。

M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 纯化后重组蛋白FliC M. Protein molecular weight marker; 1. Purified recombinant protein FliC 图2 重组蛋白FliC的Western blot 分析 Fig.2 Western blot analysis of recombinant protein FliC

2.4 小鼠攻毒保护试验

第二次免疫后30 d以马链球菌马亚种新疆株XZ1进行攻击，PBS及GST对照组全部死亡，FliC+SeM免疫组的保护率为87%，SeM免疫组的保护率67%，FliC免疫组保护率为20%，该结果表明FliC与SeM联合免疫时，免疫保护效果优于SeM单独免疫组及对照组(图5)。

3 讨 论

公共产品供给实质上是如何分配社会公共资源的问题。随着我国经济的疾速发展和一系列惠农政策的积极推行，我国农村公共产品供给已经取得明显改进。但仍然不能忽略当前我国农村公共产品供给仍然存在着诸多问题。

a. FliC+SeM蛋白包被检测血清抗体水平；b. FliC蛋白包被检测血清抗体水平；c. SeM蛋白包被检测血清抗体水平；同一时间内上标大写字母不同表示组间差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05) a. Detection of serum antibody levels that coated with FliC+SeM protein; b. Detection of serum antibody levels that coated with FliC protein antigen; c. Detection of serum antibody levels that coated with SeM protein antigen; In the same precedence, values with the difference capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01), values with the different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05) 图3 小鼠血清中特异性抗体水平的检测 Fig.3 Detection of serum specific antibody levels of mice

a. 用FliC+SeM做抗原检测不同免疫组抗体亚型水平；b. 用FliC做抗原检测不同免疫组抗体亚型水平水平；c. 用SeM做抗原检测不同免疫组抗体亚型水平；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05) a. The detection of Antibody subclass level between different immune groups by coating with FliC+SeM antigens; b. The detection of Antibody subclass level between different immune groups by coating with FliC antigens; c. The detection of Antibody subclass level between different immune groups by coating with SeM antigen; Difference capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01), difference lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05) 图4 免疫小鼠血清中特异性抗体亚型的水平检测结果 Fig.4 Antibody subtype level of mice serum

图5 马腺疫链球菌新疆株XZ1的攻击存活率 Fig.5 Survival rate against Streptococcus equi subspecies equi XZ1 challenge

SeM在马腺疫链球菌的致病和免疫逃避中意义较大[5]，尽管其是该菌的保护性抗原，目前发现其纯化蛋白诱导免疫保护的能力还有待改善。鞭毛蛋白作为一种蛋白佐剂有其独特的优势，J. S. Eom等[22]通过构建重组减毒鼠伤寒沙门菌，证明鞭毛蛋白可有效地刺激该菌产生特异性IgG抗体。包琦锋等[23]将人乳头瘤病毒(HPV)抗原基因插入到鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的超变区域，对其进行表达及纯化。J. W. Huleatt等[24]以卵清蛋白(OVA)为抗原，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC为佐剂将二者联合免疫小鼠，证明鞭毛蛋白组诱导的IgG抗体滴度明显高于铝佐剂组。研究还表明鞭毛蛋白与不同抗原融合后也可发挥其佐剂作用，赵达[17]和王鹤[25]表达鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC与金黄色葡萄球菌及链球菌的GapC融合蛋白，免疫后的结果表明FliC增强了GapC蛋白的免疫效果。

以故宫的五彩蝴蝶瓶为例，除去其排版上的失误，译文并没有传达出文物解说词的文化内涵，而是大篇幅描述了五彩蝴蝶纹瓶的外观等自然属性。中国古代瓷器装饰题材极为丰富，大多“图必有意，意必吉祥。”“蝶”与“耋”谐音，“耋”意为七八十岁的年纪，泛指老年，以“百蝶”寓长寿之意。而对相同题材的蝴蝶瓶描述，大都会博物馆则用精炼的一句话描述了其文化含义，象征意义：The Chinese term for butterfly (hudie) is also a rebus for the accumulation of blessings.(Vase with Butterflies)

在前期的研究中，我们已证实了SeM蛋白具有免疫原性和免疫保护效果[18]，本研究在此基础上将表达的SeM蛋白与FliC蛋白以复合物的形式免疫，观察鞭毛蛋白对SeM的免疫应答的影响。二免后的抗体检测结果表明，SeM抗原中加入马流产沙门菌来源的FliC后注射小鼠，FliC+SeM所诱导的SeM特异性IgG水平高于SeM单独免疫组和对照组，表明FliC可以增加血清中SeM 特异性IgG的水平，对SeM的免疫具有免疫增强反应。

TLR5配体鞭毛蛋白作为天然免疫应答的诱导剂，不仅作用的细胞范围广，其诱导的天然免疫应答还可进一步帮助机体建立针对外源抗原的获得性免疫应答。其通过活化抗原提呈细胞(APC)对抗原的加工、处理和提呈能力，可帮助小鼠产生显著而全面的免疫应答，进而可以提供强毒攻击的免疫保护。本试验中对小鼠攻击保护试验的结果也表明，FliC+SeM免疫后对小鼠的保护率为87%，明显高于SeM单独免疫的67%。

有关鞭毛蛋白诱导何种类型的免疫，不同的研究显示不同的结果。有研究表明，可溶性的鞭毛蛋白可诱导Th2型细胞介导的抗体应答，活的沙门菌表面的表面蛋白会诱导Th1型的细胞应答[25]，其中IgG1亚型与Th2型的体液免疫应答有关。本研究的结果显示，FliC重组蛋白与SeM蛋白联合免疫后可以诱导小鼠产生较高水平的IgG1抗体。该结果表明FliC+SeM诱导了Th2型的体液免疫应答，FliC有增强SeM体液免疫效应的作用。这与严明等[26]用鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与肺炎链球菌DnaJ蛋白联合免疫后抗体分型检测得出抗体亚型以IgG1为主的结果是一致的。陈志华[14]将细菌的鞭毛蛋白与口蹄疫疫苗皮下联合免疫小鼠，证明FliC对IgG1(Th2型)和IgG2a(Th1型)都有促进作用，我们分析认为这种免疫类型上的差异可能与所用的抗原类型和免疫途径不同有关。

不同病原菌的鞭毛蛋白的佐剂效应存在差异，鉴于文献报道均是以鼠伤寒沙门菌来源的鞭毛蛋白入手研究鞭毛蛋白的免疫增强效应，本研究原核表达了马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FliC，并对表达蛋白对马腺疫链球菌SeM蛋白免疫效果的影响作了初步探索。FliC能够提高免疫小鼠血清中SeM特异性IgG及IgG1的水平，下一步将进一步探讨该蛋白质通过不同免疫途径和免疫策略免疫马匹后对马腺疫强毒攻击的免疫保护力，以期为马腺疫的免疫预防提供新的思路与方法。

通报指出，李立国同志作为民政部党组书记、部长，窦玉沛同志作为民政部党组成员、副部长，管党治党不力，严重失职失责，所辖单位发生系统性腐败问题。李立国被留党察看两年处分，降为副局级非领导职务；窦玉沛则受到党内严重警告处分，终止其党的十八大代表资格，提前退休。

4 结 论

成功表达、纯化了马流产沙门菌来源的FliC重组蛋白。以该重组蛋白质与马腺疫链球菌SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠产生的抗体水平高于SeM蛋白单独免疫组，且主要以IgG1抗体为主。第二次免疫30 d后攻毒，FliC+SeM免疫组的保护率为87%，高于SeM免疫组的保护率67%。FliC蛋白能够增强SeM蛋白的免疫保护效果。

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