96序列相似的家庭成员A (family with sequence similarity 96, member A, FAM96A) 是普遍存在、高度保守、与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1)相互作用的促肿瘤细胞凋亡的抑癌基因，功能未知[1] 。关于FAM96A 在肝癌发生发展中功能未见报道。因此，本研究旨在通过检测肝癌组织和细胞中FAM96A表达, 并统计分析FAM96A在肝癌组织和配对癌旁组织中的表达差异与肝癌临床病理特征及预后的关系，初步探讨FAM96A在肝癌中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料 在通过华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院医学伦理委员会批准并获得患者本人及家属同意的情况下，本次研究选择本院2015年1月～2016年12月收治的48例肝癌患者为研究对象。肝癌组织标本和距肿瘤边缘>2 cm处癌旁组织标本均置于-80 ℃ 保存备用。

1.2 主要试剂 FAM96A、β-actin一抗及二抗均购自英国Abcam公司；RNA提取、逆转录及SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司；总蛋白抽提试剂盒、电化学发光试剂盒均购自美国Invitrogen公司；细胞培养基、胎牛血清、胰酶均购自日本Sigma公司。

教学目标以传授知识和技能向运用已有技能和知识转变；教学形式以教师教为主、学生被动学习向以学生为主体、在老师指导下主动学习转变；交流方式以单方面、既有互动也有被动向双向转变；参与程度以学生要我学向我要学转变；运用激励手段挖掘学生内在潜力，提高学生的动手能力、合作精神和学习效果。

1.3 Real-time PCR法检测FAM96A mRNA表达 提取组织标本和细胞中的总mRNA，取4 μg mRNA按照逆转录试剂盒的使用说明合成cDNA，逆转录获取的cDNA置-20℃ 保存备用，其余RNA置-80℃ 保存备用。Real-time PCR总反应体系20 μl：SYBR Green 10 μl，上下游引物浓各0.6 μl(浓度均为10 μmol/L)，cDNA 2 μl，DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水补齐至20 μl。反应条件为变性、退火及延伸，设定35个循环。本实验中，肝癌组织和细胞所用FAM96A 和β-actin引物、Real-time PCR总反应体系和设定的反应条件均相同，由Real-time PCR仪自动生成数据。引物序列如下。FAM96A F：5′-GCAAAGCACGCTGGAACT-3′，R：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′；β-actin F：5′-TGAGA CCTTCAACACCCCAG-3′，R：5′-GCCATCTCTTGCTC GAAGTC-3′。

对于突发事件的出现，教师要迅速做出反应，根据问题的实际情况采取合理的措施。把事态扼制住，避免对课堂产生进一步的影响。例如：在足球教学比赛中，因为犯规而引起的学生间的争执。教师要及时阻止事态发展，引导学生“友谊第一，比赛第二”。

1.5 统计学处理 所有的数据均通过SPSS 18.0软件完成统计分析。计量资料以表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.2 FAM96A在细胞中的表达 与L02细胞相比，FAM96A在HepG2细胞中mRNA表达显著降低 (0.500±0.111 vs 1.654±0.285, t=26.153, P<0.001)， FAM96A在HepG2细胞中蛋白表达同样降低(0.612±0.245 vs 1.375±0.271, t=14.478, P<0.001)。

研究表明HCC的发生发展是包括病毒或化学物质的作用导致癌基因激活和/或抑癌基因失活在内的多阶段多步骤过程[5]。FAM96A与FAM96B属于同源蛋白，均通过相互作用蛋白发挥功能，具体机制不明确。目前国内外对FAM96B的功能研究已取得突破性定进展, 研究结果证实FAM96B与甲基磺酸敏感性基因19、着色性干皮病基因D组成蛋白复合物发挥功能。在人肝癌、结肠癌组织中低表达，参与肿瘤的发生发展，定位于纺锤体，在有丝分裂染色体正常分离中发挥关键作用，FAM96B基因沉默可导致肿瘤细胞不能正常有丝分裂，异型细胞核堆积，细胞凋亡，是癌症潜在的诊断和治疗靶点[6-9]。但国内外关于FAM96A的研究报道却很少，最新研究[1]表明，FAM96A与CIA2A组成蛋白复合物CIA2A-FAM96A维持细胞铁稳态。目前未见FAM96A在人肝癌中的功能研究报道。因此，本研究旨在探索FAM96A在肝癌组织中的表达差异及临床意义，以期为肝癌诊断和治疗提供新的靶点和思路。

2.1 FAM96A在组织中的表达 Real-time PCR检测结果显示，FAM96A在肝癌组织中的mRNA表达低于癌旁组织(0.447±0.117 vs 1.526±0.323, t=21.773, P<0.001)。Western blot 检测结果显示：与癌旁组织比较，FAM96A在肝癌组织中的蛋白表达显著降低(0.701±0.207 vs 1.452±0.262, t=15.582, P<0.001)，见图2。

原发性肝细胞性肝癌(primary carcinoma, HCC)简称肝癌，是恶性程度极高、预后极差的较为常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康与生命财产安全[2]。最新流行病学资料显示，我国肝癌的发病率位列世界第一，死亡率在癌症相关死因中排列第四，5年生存率仅为10%，复发和转移是导致生存率低的主要原因。一般认为肝癌的发生与乙型肝炎病毒感染和黄曲霉毒素摄入有关, 但机制不明[3-4]。因此，深入研究肝癌发生机制对于肝癌预后具有重大临床意义。

图1 肝癌组织及癌旁组织中FAM96A的mRNA和蛋白表达

A：mRNA表达；B：蛋白表达; 与癌旁组织比较：*P<0.05

图2 HepG2细胞和L02细胞中FAM96A的mRNA和蛋白表达

A：mRNA表达；B：蛋白表达;与癌旁组织比较：*P<0.05

表1 FAM96A蛋白表达差异与肝癌临床病理特征之间的相关性

临床病理特征例数表达量t值P值性别 男340.617±0.2340.3230.748 女140.591±0.287年龄(岁) ≤50300.613±0.2430.0350.972 >50180.610±0.256肿瘤大小(cm) ≤5180.853±0.1818.1900.000 >5300.467±0.143肿瘤数目 单发310.605±0.211-0.8790.384 多发170.614±0.316乙肝 阳性410.618±0.2530.4020.689 阴性70.577±0.201肝硬化 有380.605±0.240-0.4610.647 无100.645±0.275血清AFP(ng/ml) ≤20150.681±0.2331.3200.193 >20330.581±0.247门静脉癌栓 有130.328±0.070-6.9340.000 无350.717±0.197肝外转移 阳性80.281±0.034-5.2250.000 阴性400.678±0.212Child分级 A390.686±0.2085.6550.000 B90.289±0.040BCLC分期 A280.772±0.1828.5290.000 B+C200.388±0.101

3 讨论

2.3 FAM96A蛋白表达水平与肝癌临床病理特征之间的关系 FAM96A蛋白表达差异与本研究中48例肝癌患者肿瘤大小、是否合并门静脉癌栓、是否发生肝外转移、Child分级、巴塞罗那肝癌分期(Barcelona clinical liver cancer staging system, BCLC)之间差异有统计学意义(P<0.001)，然而与患者的性别、年龄、肿瘤个数、是否合并乙肝、是否合并肝硬化、血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)无明显相关性(P>0.05)。见表1。

不同于以往的结构调整，农业供给侧结构性改革不是简单的生产品种结构调整，而是一场面广度深、牵一发而动全身的广域变革，是在我国农业发展到较高水平上的主动作为，是在城乡一体化深入推进背景下的统筹调整，是在国内国际市场深度融合趋势下的应时之举。更注重质量、效益、可持续发展；更关注产业结构、技术结构、经营结构；更强调农民增收、农业增效、农村增绿；更注重体制改革机制创新，激活农业农村发展的内生动力。

1.4 Western blot法检测FAM96A蛋白表达 分别称取0.08 g肝癌组织和癌旁组织、待细胞生长至80%～90%汇片时收集细胞，提取蛋白并定量。各组取120 μg蛋白样品上样于浓度为5%的浓缩胶和15%的分离胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳条件设定为：浓缩胶80 V，分离胶100 V。PVDF膜转移蛋白， 封闭一抗，标记二抗，电化学发光法显影。

分析基因与肿瘤关系的基础是观察肿瘤组织及配对癌旁正常组织的差异性表达，异常表达的基因被认为是潜在的新的调控细胞增殖与凋亡的癌基因和/或抑癌基因，极有可能在肿瘤的恶性进展中扮演重要角色[10]。本研究团队分别采用Real-time PCR和Western blot技术检测FAM96A在基因和蛋白水平的表达差异。检测结果表明：与癌旁组织比较，FAM96A在肝癌组织中的蛋白和mRNA表达均显著降低，同时，与人正常胎肝细胞系L02相比，FAM96A在人肝癌细胞系HepG2中的蛋白和mRNA表达均明显降低。本研究分别从人体组织标本及人肝癌细胞系两方面证实FAM96A在肝癌发生发展中发挥一定作用。FAM96A可能是一种潜在抑癌基因直接或间接抑制肝癌和其他肿瘤的发生发展。Zhang et al[11]通过建立H22荷瘤裸鼠模型探索外源性FAM96A在动物体内对肿瘤的作用，研究结果证实FAM96A抑制裸鼠肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡、降低死亡率。Schwamb et al[12]报道FAM96A与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1)相互作用，通过线粒体凋亡途径对间质瘤发挥促凋亡作用。过表达FAM96A可促进间质瘤细胞系GIST882凋亡，并在体内和体外抑制间质瘤生长。FAM96A低表达或基因沉默将导致间质瘤的发生。本研究结果与国外文献报道基本一致。

笔者通过统计分析FAM96A蛋白表达差异与肝癌临床病理特征之间的相关性得出：FAM96A蛋白在肝癌组织与癌旁组织中的蛋白表达差异与48例肝癌患者的性别、年龄、肿瘤个数、是否合并乙肝、肝硬化、AFP无明显相关。目前，肝癌筛查、早期诊断、预后评价较为实用的诊断方法是血清AFP检测。但并非所有肝癌细胞都分泌AFP，且部分患者AFP值并不升高。因此AFP用来诊断肝癌容易造成漏诊[13]。本研究结果中FAM96A在肝癌组织中的表达与AFP无关，即FAM96A有可能成为不依赖AFP的肝癌标记物。肿瘤细胞与正常细胞区别的重要生物学特征是肿瘤细胞会无限侵袭和转移，肿瘤细胞脱离原发灶，侵犯周围组织、血管及淋巴管，进入循环系统并向远处组织侵袭扩散形成新的转移灶，转移灶在血供充分的情况下即增殖形成转移瘤[14-15]。本研究结果显示FAM96A在肝癌组织中低表达与与肿瘤大小、门静脉癌栓、远处转移、Child分级、BCLC分期密切相关。本研究结果有力地证实FAM96A可能是一个与肝癌恶性进展相关的分子生物学标志物，极有可能在肝癌恶性进展中起到直接或间接的抑制作用。

该团队经十余年攻关，通过EMS诱变和遗传突变筛选，获得了一种新型的水稻品系“小薇”。它具有生长周期短、株型和生物量小、空间利用率高等优势，可以像双子叶模式植物拟南芥一样，在实验室内进行大规模种植和筛选，并且实现表型精确鉴定。通过对“小薇”遗传背景下的节间伸长控制基因和散生基因的克隆，验证了“小薇”的实用性和室内研究体系的可操作性。研究发现，“小薇”的超矮秆表型是由于D18的突变导致。该种突变体除株高显著降低外，其他农艺性状与野生型无显著性差异。

综上所述，笔者从新鲜肝癌组织标本、肝癌细胞株等方面对FAM96A的功能进行研究，发现FAM96A可能是一种新的抑癌基因，在肝癌恶性进展中发挥关键作用。提示FAM96A可能成为一个新的肝癌生物学标志物，为寻找肝癌基因靶点提供有利证据。本研究虽然对FAM96A在肝癌发生发展中的功能研究取得了初步进展，但仍有许多未知领域需要科研工作者不断探索，如：FAM96A在除肝癌外的其他肿瘤组织中的表达差异，FAM96A过表达或基因沉默对肿瘤细胞增殖凋亡和侵袭转移等生物学功能、细胞有丝分裂的影响及机制，外源性FAM96A对裸鼠移植瘤生长抑制、凋亡和转移的影响等。相信随着不断探索与创新，FAM96A的细胞生物学功能研究将得到突破性进展，FAM96A抑制肿瘤细胞恶性进展的作用将被裸鼠移植瘤模型的体内实验所证实，为进一步的临床应用提供可靠数据。

参考文献

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