结肠癌是常见的肠道恶性肿瘤，流行病学调查显示，每年全球新诊断结肠癌的患者为120万人，死亡人数超过60万[1]。2型糖尿病作为结肠癌发病的因素，已得到广泛认可[2]。Evans等首先发现，二甲双胍可降低2型糖尿病患者罹患多种恶性肿瘤的机率[3]。二甲双胍对结肠癌癌细胞等具有抑制增殖、促进凋亡的作用[4]。磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白酶B/激酶-3(PI3K/AKT/GSK-3β)信号通路在多种肿瘤细胞中呈高表达，该通路的激活，使磷酸化AKT(P-AKT)过度表达后作用于下游靶因子GSK-3β，对于乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾远端小管肿瘤细胞具有促进增殖、分化及抑制凋亡等作用[5-9]。二甲双胍对结肠癌细胞是否也是经过该通路发挥抗癌作用呢？本实验以Western-blot检测PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白的表达量变化，初步探讨二甲双胍抑制人结肠癌细胞的可能机制，报道如下。

看他提着菜篮，仰起小脸儿，映在满眼的槐花中，那神态跟他狼剩儿哥一模一样！当年的情形恍如昨日：我踮起脚尖儿，摘下槐花递给狼剩儿，他提着菜篮跟在后头，到提不动了，才把菜篮放地上，再来接过我摘下的花串儿……槐花年年开，可当年立在花下的那个小人儿，如今还流落在远方的他乡。瞄着眼前的槐生，这个小人儿也是立在花下。一念百感生，我悄悄流出泪来。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 人结肠癌HT29细胞(华北理工大学实验中心细胞库)；二甲双胍(美国Sigma公司)；RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司)；胰酶(美国Hyclone公司)；MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)。光镜及倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；二氧化碳细胞培养箱(ECO2 150型，美国New brunswick scientific)；流式细胞仪(美国BD公司)；酶标仪(上海Bio-Rad公司);BCA蛋白浓度检测试剂盒，兔抗人PI3K，AKT，P-AKT，GSK-3β,P-GSK-3β抗体及HR标记羊抗鼠二抗，HR标记羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术研究所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 培养环境：37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱。培养基：含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养方式：隔天更换新鲜培养基，观察、收集对数期生长的HT29细胞。

2.1 二甲双胍对HT29细胞增殖的影响 MTT法检测结果显示，同一浓度的二甲双胍，干预的时间越长，抑制率越高；相同干预时间的二甲双胍，干预浓度越高，抑制率也越高(均为P<0.05，表1)，即二甲双胍对该细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈浓度-时间效应关系。

抑制率(%)=(1-二甲双胍干预组OD值/对照组OD值)×100%

1.3 统计学处理 数据以表示，采用SPSS 22.0软件进行处理。2组均数间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差别有统计学意义。

2.3 二甲双胍对HT29细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，对照组及5，10，20，40 mmol/L的二甲双胍干预组的凋亡率分别为(5.61±0.16)%，(7.66±0.09)%，(9.91±0.20)%，(12.26±0.17)%及(15.96±0.45)%，即二甲双胍干预组的凋亡率均较对照组升高，且具有浓度趋势，差别具有统计学意义(P<0.05;图2,3)。

人民满意的教育，只有开头，没有结尾；广州好教育，只有起点，没有终点。在屈哨兵局长的带领下，一群对教育用心、用情、用力的教育人正在路上，也永远在路上；对好教育的探索与追寻正在路上，也永远在路上。我们相信，有他们的努力，古老而又年轻的广州将迎来教育大发展、民生更幸福的美好明天！

回顾文献可以发现，如何促进区域产业结构升级以及减弱人口老龄化的不利影响是我国目前面临的两大难题。大部分学者基于已有的经济区域划分，将老龄化指标直接作为解释变量构建计量模型。本文将人口老龄化指标引入至新古典经济增长模型中，借助产业结构与经济产出之间的关系得到具有人口老龄化约束的产业结构升级优化模型，通过因子聚类分析所创建的新划分区域，分析各区域产业结构发展的着重点并提出相应建议。

1.2.4 Annexin V-FITC和PI双染法流式仪检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，二甲双胍干预组用5，10，20，40 mmol/L的二甲双胍干预48 h，0.25%胰酶处理，PBS清洗3遍后收集细胞，加入300 μL的1×Binding Buffer悬浮细胞。加入5 μL的Annexin V-FITC混合，避光，室温培育15 min。上机前5 min加入5 μL的Propidium Iodide染色，加入1×Binding Buffer 200 μL，随即上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.2.5 Western-blot法检测相关蛋白表达 (1)收集细胞：将对数生长期的HT29细胞，分为对照组和浓度为5，40 mmol/L的二甲双胍干预48 h的二甲双胍干预组。(2)电泳：使用BCA法测定细胞裂解获取的蛋白量。把5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入等量的蛋白中，100 ℃沸水加热3 min，蛋白充分变性后，-80 ℃冷却保存。使用SDS-PAGE试剂盒配置分离胶和浓缩胶，蛋白上样电泳。(3)转膜：将变性蛋白转移到PVDF膜上，加入5%脱脂奶粉，室温封闭2 h。(4)一抗孵育：加一抗(分别为各相关蛋白及GAPDH一抗，稀释比为1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜。(5)二抗孵育：TBST液洗膜6 min×3次，再将膜与相应二抗(1∶1 000)常温孵育2 h，再次TBST缓冲液洗膜5 min×3次，ECL显色盒显色。(6)蛋白检测：使用Image J软件检测条带。

相对灰度值=(目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值)×100%

9个地区供试土壤其吸附数据的拟合结果见表2。伪二级动力学模型的r2值为0.962～0.999，说明拟合效果很好；而Elovich模型的r2值为0.643～0.962，拟合效果较差。伪二级动力学模型包含了土壤颗粒周围的液膜扩散、在土壤颗粒内部的内扩散以及在土壤吸附位点的物理或化学吸附等[14]，因此其相比Elovich模型能更好地描述9个地区土壤吸附Cd的动力学过程，更真实并全面地反映Cd在土壤上的吸附机理。

2 结 果

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 取对数生长的细胞悬液，0.25%胰酶处理后再次悬浮，最终浓度为5×104 mL-1。按每孔5 000个细胞，即每孔0.1 mL的细胞悬浮液接种于96孔板。细胞贴壁后更换培养基。随机分为2组，二甲双胍干预组加入5，10，20，40 mmol/L的二甲双胍，对照组则加入等量的PBS，每组设置5个复孔，分别培养24，48，72 h，每隔24 h更换培养基1次。取一块板，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃去孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL，避光振荡10 min，上酶联免疫检测仪，检测波长为492 nm处的吸光度(OD)，按照下列公式计算细胞的生长抑制率：

二是计算机实验室没有实现多功能化、高效化共享使用。计算机实验室还是单一功能的实验室，没有做到一台机多系统、多功能使用。传统实验室分为计算机公共课实验室、软件实验室、硬件实验室、网络实验室、图形实验室等，各实验室承担实验课单一，设备利用率偏低，没有充分做到实验室多功能化、高效共享应用。

表1 二甲双胍对HT29细胞生长抑制率

Tab 1 Effect of metformin on growth of HT29 cells %

分组t干预/h244872对照组0．00±0．000．00±0．000．00±0．00二甲双胍干预组/(mmol·L-1)521．29±3．04☆31．72±4．22☆△35．71±2．42☆△1033．95±3．80☆▲41．35±3．12☆△▲42．73±3．64☆△▲2059．68±2．15☆▲64．38±1．92☆△▲66．44±1．05☆△▲4076．07±1．62☆▲81．41±1．53☆△▲83．73±1．01☆△▲

与对照组比较，☆：P<0.05；同一浓度下，与24 h组比较，△：P<0.05；同一时间下，与上一浓度处理组比较，▲：P<0.05.

A：对照组；B～E分别为5，10，20，40 mmol/L的二甲双胍干预组. 二甲双胍干预组较对照组、药物干预高浓度组较低浓度组细胞数目减少，细胞由多边形变为圆形，体积缩小，核固缩，细胞核溶解等凋亡现象愈加明显. 图1 光镜下观察各组HT29细胞的形态( ×200) Fig 1 The morphology of HT29 cells was observed under light microscope( ×200)

1.2.3 光镜观察 HT29细胞在5，10，20，40 mmol/L的二甲双胍干预24 h后，于光学显微镜下观察形态学改变，每组随机选择10个视野拍照。

2.2 二甲双胍对HT29细胞形态学的影响 光镜下观察各组的细胞形态，较之对照组，二甲双胍干预组的细胞数目减少，细胞形状由多边形变为圆形，体积缩小，核固缩，细胞核溶解等，且随着二甲双胍浓度的增高，凋亡细胞比例升高(图1)。

A：对照组；B～E分别为5，10，20，40 mmol/L的二甲双胍干预组. 图2 流式细胞仪检测HT29细胞的凋亡率 Fig 2 The apoptotic rate of HT29 cells was detected by flow cytometry

与对照组比较，☆：P<0.05； 与前一浓度干预组比较，△:P<0.05. 图3 二甲双胍对HT29细胞凋亡的影响 Fig Effect of metformin on apoptosis of HT29 cells

2.4 二甲双胍对HT29细胞相关蛋白表达的影响Western-blot检则结果显示，培养48 h后，各浓度二甲双胍干预组的AKT及GSK-3β蛋白表达量与对照组比较，差别均无统计学意义(P>0.05，图4)；而5 mmol/L的二甲双胍干预组的PI3K，P-AKT及P-GSK-3β的蛋白表达量均较对照组减少(P<0.05，图5)；40 mmol/L组的PI3K，P-AKT及P-GSK-3β蛋白表达量也较5 mmol/L组明显减少。即二甲双胍的干预降低了HT29细胞PI3K，P-AKT及P-GSK-3β蛋白的表达，且呈浓度依赖性。

3 讨 论

结肠癌是常见的肠道恶性肿瘤，近年发病率持续上升，治疗方法有手术和化疗等[10-12]。化疗疗效确切，但也存在副作用及耐药等问题。Evans等首次报道，二甲双胍在降血糖的同时也可减少2型糖尿病患者发生多种恶性肿瘤的机率[3]。高糖和胰岛素抵抗与肿瘤的发生存在正相关[13]，二甲双胍作为常规口服降糖药，降糖效果较好，可通过降低肝糖原输出(减少糖的来路)及增加外周器官的糖利用(增加糖的去路)降糖[14]。此后多个流行病学报道也均证明Evans等的研究结果[15]。文献还报道，二甲双胍还可以降低结肠癌患者的术后死亡率[5]。

图4 PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白印迹图 Fig 4 PI3K/AKT/GSK-3β athway-associated protein blotting

A：PI3K； B：AKT；C：P-AKT； D：GSK-3β； E：P-GSK-3β. 低浓度组与对照组、高浓度组与低浓度组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01. 图5 PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白相对表达量 Fig 5 PI3K/AKT/GSK-3β pathway-related protein relative expression

有关肿瘤通路的研究显示，PI3K/AKT/GSK-3β通路参与较多的基因转录、蛋白表达及细胞凋亡，从而发挥生物学功能[16]。PI3K可分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型，目前的研究热点是Ⅰ型，该型又分Ⅰa和Ⅰb 2个亚型，它们传递信号于细胞受体之间。PI3K可产生相应的第二信使，第二信使激活下游蛋白P-AKT。GSK-3β是细胞内丝氨酸/苏氨酸家族激酶，为AKT的底物。P-GSK-3β蛋白调控凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比例，参与肿瘤细胞的增殖和凋亡。通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路，减少磷酸化AKT表达后作用于下游靶因子GSK-3β蛋白，对多种肿瘤细胞具有抑制增殖及促进凋亡等作用[5-9]。PI3K/AKT/GSK-3β通路在结肠癌细胞中呈高表达[12]，二甲双胍是否也是通过该通路起到抑制肿瘤的作用呢？肿瘤的生物学特性之一是细胞迅速增殖。研究发现，抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白表达，可抑制乳腺癌、前列腺癌细胞增殖[17-18]。细胞凋亡是细胞正常的程序死亡，而肿瘤细胞凋亡失调。抑制PI3K/AKT通路相关蛋白的表达，可促进乳腺癌、肾远端小管肿瘤细胞凋亡[19]。本实验结果显示，相同浓度组二甲双胍的干预时间越长，抑制率越高；相同时间组二甲双胍的干预浓度越高，抑制率也越高，说明二甲双胍对人结肠癌HT29细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓度-时间效应关系。进一步通过光镜观察各组的细胞形态发现，较之对照组，二甲双胍干预组的细胞数目减少，细胞形状由多边形变为圆形，出现体积缩小、核固缩、细胞核溶解等凋亡现象，且随着药物干预浓度的增高，细胞凋亡比例也升高。流式细胞仪测量也显示，二甲双胍干预组的凋亡率较对照组明显升高，且各干预组的凋亡率有浓度依赖性。说明二甲双胍具有促进人结肠癌HT29细胞凋亡的作用。通过Western-blot实验检测，二甲双胍干预HT29细胞，对AKT及GSK-3β蛋白的表达量无明显影响，而对PI3K，PAKT及P-GSK-3β蛋白的表达量具有抑制作用(呈浓度依赖性)。

综上所述，二甲双胍对人结肠癌HT29细胞具有抑制增殖及促进凋亡的作用，其机制可能与抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路的PI3K，PAKT及P-GSK-3β蛋白表达有关。本实验为体外实验，理论上为二甲双胍抗结肠癌提供了支持，具体应用于临床还需进一步探索。

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