现今社会趋势晚婚晚育，随年龄增大令女性卵泡的数量和质量明显下降,令高龄备孕妇女需要面对自身卵巢储备能力下降(diminished ovarian reserve，DOR)的挑战。DOR是指卵巢内存留的可募集卵泡数量减少，卵子成熟能力减弱，卵泡质量下降，导致女性生育能力下降及性激素缺乏的疾病；占不孕妇女总数约10%, 是目前引起不孕的主要原因之一[1]。

七子益肾理冲汤为当代名老中医、妇科名家肖承悰教授所创,是治疗卵巢储备功能低下及卵巢早衰的经验方。师门临床研究显示，七子益肾理冲汤改善卵巢早衰妇女月经周期、经期、经色、经质，亦改善患者烘热汗出、阴道干涩等肾虚血瘀之临床症状；前期动物实验研究亦显示七子益肾理冲汤改善DOR大鼠血清性激素FSH、E2水平及卵巢储备指标AMH的水平，表示七子益肾理冲汤能改善卵巢储备功能低下。本课题将采用TUNEL检测颗粒细胞调亡率，及计数各级卵泡数及黄体数量反映卵泡库情况,以初步探讨七子益肾理冲汤调控卵巢储备的机理。

1　材料与方法

1.1　实验动物

60只SPF级SD大鼠，雌性，8周龄，200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。动物适应7天环境，自由饮水饮食，室温(21+/-2)℃，湿度(40+/-10)%，光照周期12/12h。进行阴道涂片，检查动情周期，连续观察2个动情周期正常者纳入实验。

1.2　实验药物与试剂

七子益肾理冲汤组成：女贞子15 g、枸杞子15 g、菟丝子15 g、沙苑子15 g、覆盆子15 g、桑椹15 g、香附15 g、桑寄生15 g、川续断15 g、巴戟天15 g、熟地黄15 g、白芍15 g、黄芪15 g、黄精15 g，实验之中药药物为浓缩中药颗粒，由培力(香港)有限公司生产之农本方中药颗粒，临用前加双蒸水配成低、中、高浓度的混悬液；脱氢表雄酮(dehydroepi- androsterone，DHEA)美国GNC出产之25 mg DHEA，购自香港牛奶有限公司旗下万宁连锁店；DHEA药片研磨，溶于生理盐水配成混悬液；TUNEL原位细胞凋亡试剂盒：瑞士Roche(POD批号：11684817910)；DAB染色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；蛋白酶K(美国Genview)。

1.3　动物分组和模型建立

实验动物共分为6组，分别为：空白组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组及DHEA组，每组实验动物各10只。

将所有大鼠编号，使用随机数字表法将大鼠随机分为两组：空白对照组(空白组)10只、DOR造模组50只。DOR造模组大鼠，每日于9时定时腹腔注射脱氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene dioxide，VCD)，VCD稀释至浓度约8 mg/mL备用，每只大鼠根据体重调整给药量，每100 g体重注射1 mL，连续用药15天。用药后进行阴道脱落细胞涂片观察，模型大鼠出现动情周期紊乱时，即确定DOR模型造模成功。

1.4　给药方法

末次给药2小时后，称量体重；大鼠摘眼球取血，待血液凝固后，室温下以3000 r/min 离心15分钟，取上清液，分装于Eppendorf管，-80℃保存备用；处死大鼠，摘取双侧卵巢及子宫，分别量度卵巢及子宫的体积, 及天平上称湿重后, 一侧卵巢组织液氮保存，另一侧放于固定液中，石蜡包埋，切片备用。

低、中、高剂量组的剂量：七子益肾理冲汤每天人类的临床用量为0.6 g/kg；而实验中的低、中、高剂量组的剂量分别相当于临床等效剂量的0.5、1、2倍。大鼠用量计算根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”，低剂量组浓缩中药的每日用量为： 1.89 g/kg ; 中剂量组浓缩中药的每日用量为: 3.78 g/kg; 高剂量组浓缩中药的每日用量为7.56 g/kg。实验之中药药物为浓缩中药颗粒，临用前加双蒸水配成低、中、高浓度的混悬液, 灌胃给药，每只大鼠按每100 g灌胃1 mL,每天1次，连续15天(约为3个大鼠动情周期)。西药组：DHEA用量6.75 mg/kg，经计算用量后，以DHEA药片研磨及溶于生理盐水至浓度为0.675 mg/mL，组内大鼠根据体重灌胃给药，每100 g灌胃1 mL，每天1次，连续15天。空白对照组及模型组：按体重每100 g灌胃1 mL 0.9%生理盐水,每天1次，连续15天。

早在胎儿期间，人类的卵巢就有卵泡存在。由胚胎6～8周开始，就出现了原始生殖细胞的不断有丝分裂，细胞数增多，体积增大，称为卵原细胞(oogonia)，其细胞的量约为60万个，随着胎儿的生长到11～12周开始，卵原细胞减数分裂成卵母细胞(primary oocyte)，到16～20周时生殖细胞数量达到高峰，达600～700万个(卵原细胞占1/3，初级卵母细胞占2/3)。随着胎儿的生长，该细胞反而逐渐减少，到了妊娠40周超过三分之二的卵母细胞因调亡机制而死亡，减少到约200万个卵母细胞，而初级卵母细胞被颗粒细胞所包围形成原始卵泡(primordial follicle)，为女性基本生殖单位，也是卵细胞储备的唯一形式[1]。出生后很多卵泡调亡，在发育的各个阶段通过细胞凋亡机制而逐渐退化，此即称为卵泡闭锁[2]。直至青春期，约有75%的原始卵泡死亡[3]。育龄期女性每个月经周期中一般只有一个优势卵泡得以发育完全成熟，并排出卵子，说明多数卵泡都无法在卵巢中发育成熟，大都在凋亡机制中发生退化、闭锁。卵泡发育至成熟的基本条件取决于卵泡内颗粒细胞的增殖与分化，而颗粒细胞的凋亡则是卵泡闭锁的前提条件，并能直接影响卵泡的数量和质量。

课前预习效果V1（80.2）中学习目标明确V11（81.8）得分较高，预习材料掌握V12（77.9）、预习任务完成V13（78.6）得分较低，反映任课教师在给学生准备的课前预习资源包中，对于学习目标的表述学生较易消化认可；但是预习材料可能由于难易设置不恰当、呈现形式呆板等问题，学生掌握不够好，这也就直接导致了预习任务完成不理想。当然，这也可能是学生自觉性较差等原因导致的，需要任课教师进行有针对性的调研分析。

1.5　指标检测

从卵巢组织HE病理切片镜下观察可见，空白组卵巢皮质结构正常，可见有许多原始卵泡、各级卵泡，卵泡形态大小各异，卵泡内卵母细胞大而圆，轮廓清晰，及并见大量黄体分布，形态正常；模型组部分卵巢皮质有萎缩，原始卵泡减少，闭锁卵泡增多， 黄体减少； 中药高剂量组及西药组卵巢皮质中原始卵泡较模型组有所增加，中药低、中、高剂量组及西药组闭锁卵泡数量较模型组有所降低，黄体数量有所增加。

卵巢颗粒细胞凋亡率(TUNEL法)卵巢石蜡切片以TUNEL法进行检测, DAB反应显色后,在光学显微镜计数并拍照。每组内每张切片随机挑选200倍视野进行拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，在镜下选取一个视野的颗粒细胞进行计数，正常颗粒细胞呈蓝色，凋亡细胞呈棕色，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞, 即凋亡细胞,结果判断计数凋亡细胞(棕黄色)与总细胞(视野中全部细胞：棕黄色+蓝色)；两者的比值%为凋亡率。

3.1.1 LibQUAL+TM的演变。LibQUAL+TM是基于SERVQUAL提出的一种适用于图书馆的质量评价模型[4]。

1.6　统计学处理

全部数据使用统计软件SPSS 22.0进行分析，计量资料采用均数±标准差±s)表示，若数据符合正态分布，且方差齐，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　各级卵泡数、闭锁卵泡数及黄体数量

各级卵泡数、闭锁卵泡数及黄体数量一侧卵巢包埋切片后，制作苏木素—伊红(hematoxylin-eosin, HE)病理切片，后在显微镜下40×、100×及200×观察卵巢显微结构，并参考卵泡分级标准，由专业人员阅片，采用单盲法独立统计, 100×显微镜下进行大鼠卵巢切片标本中的各级卵泡总数、成熟卵泡数及黄体计数。每组观察统计6个卵巢，每个卵巢观察统计5张切片。

各组间原始卵泡数量、生长卵泡数量有显著差异，当中模型组、中药低剂量及中剂量组的原始卵泡数量及生长卵泡数量较空白组显著下降(P<0.05)，而中药高剂量组及西药组的原始卵泡数量及生长卵泡数量与空白组比较则无显著差异(P>0.05)。见表1。

近期，水利部印发《关于切实加快重点水利项目建设进度的通知》，要求各地切实落实加快重点水利项目建设各项责任，着力解决影响水利项目建设进度的关键问题，加快2012年重点项目建设进度，如期、优质、高效完成年度水利建设任务。

2.2　各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率

空白组大鼠的卵巢颗粒细胞凋亡率在所有组别中为最低水平，对照组及其他各组颗粒凋亡率较空白组明显上升(P<0.05)；经治疗后，中药中剂量、高剂量组及西药组大鼠比较模型组，TUNEL颗粒细胞凋亡率均明显降低，存在显著性差异(P<0.05)。在各个给药组之间，西药组与中药中剂量及高剂量组互相比较，对凋亡率未见显著性差异。

TUNEL法检测发现，凋亡阳性细胞染色呈褐色细颗粒状，位于细胞核。凋亡阳性细胞细胞核的形态不规则，发生核浓缩或靠边，外观呈环状或呈新月形，核中发现了棕黄色颗粒，其分布方式为弥漫性或局部性，呈阴性的凋亡细胞具有正常的细胞核，对后者进行染色后因甲基绿染色故呈均匀的淡绿色。

 

注：A空白组；B模型组;C低剂量组;D中剂量组;E高剂量组;F西药组

 

图1　卵巢组织病理切片图(HE，×200)

 

表1　不同组间大鼠各级卵泡及黄体数量比较±s)

  

分组n原始卵泡生长卵泡成熟卵泡黄体闭锁卵泡空白组610．83±2．4815．00±2．370．83±1．176．67±2．504．83±2．04模型组62．67±1．03a5．17±2．14a0．83±0．983．67±2．669．50±6．86低剂量组61．50±3．21a6．17±8．38a0．33±0．826．17±2．145．33±2．25中剂量组62．50±1．38a7．00±4．34a1．00±1．556．83±1．726．67±7．76高剂量组66．83±11．658．50±11．590．33±0．524．67±2．946．83±2．93西药组66．33±3．678．00±4．290．33±0．529．50±5．655．17±6．05F2．6912．6150．5842．3750．667P0．0400．0450．7120．0630．651

注：与空白组比较，aP<0.05。

 

注：A空白组；B模型组；C低剂量组；D中剂量组；E高剂量组；F西药组

 

图2　各组卵巢颗粒细胞凋亡TUNEL图片(HE，×200)

 

表2　各组间大鼠卵巢颗粒细胞TUNEL凋亡率比较±s)

  

分组视野数凋亡率(%)空白组1015．92±4．73模型组1067．53±9．30a低剂量组1056．45±8．44a中剂量组1051．75±14．95ab高剂量组1052．20±24．86ab西药组1041．97±25．01abF11．495P<0．001

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

3　讨论

3.1　颗粒细胞凋亡与卵巢储备功能的关系

在施工前必须进行实地测量，为石材和木饰面等施工大样图、外加工图提供精确的数据。一般土建结构的实际尺寸会与图纸上有部分出入，为了保证装饰构件材料的施工进度及质量，必须要按实际尺寸进行加工调整。各个装饰交界面的尺寸控制也要参照实际已完成的尺寸。由于现场施工条件的有限性，构件现场加工的精度及质量没有工厂里加工有保证。所以可以在工厂加工的装饰构件，比如门框、门套和门以及木饰面板等，都安排在工厂生产制作，提高构件的质量。

3.2　VCD致DOR模型与各级卵泡数量的关系

DOR的生理病理复杂，至今仍无关于确切病因及发病机制的定论，然而较具公认性的DOR主要机制包括：卵母细胞过快耗竭所致及颗粒细胞的正常增殖与分化功能低下或颗粒细胞凋亡则导致卵泡闭锁[4]。本课题主要研究针对的是DOR原始和初级卵泡的闭锁及相关之卵巢颗粒细胞凋亡，故本研究采用化学毒物VCD方案，制备卵巢储备功能低下(DOR)的动物模型。VCD加速卵泡闭锁的自然凋亡过程[5]，其化学毒性对卵巢伤害以原始卵泡及初级卵泡为主，针对加速原始和初级卵泡的闭锁，与DOR患者卵巢内存留的可募集卵泡数目减少的情况更贴近。有关评价模型之可行性，主要有以下几个评估依据：阴道涂片观察显示大鼠动情周期延长；显微镜下显示卵巢萎缩，窦前及窦状卵泡数减少、闭锁加剧，卵巢间质增生明显等。本实验研究设计上，先从阴道涂片评价造模的结果，其后实验结果亦提示应用VCD诱导的DOR大鼠模型作为研究DOR的动物模型情况理想：VCD的毒性损害卵巢功能，卵泡中卵母细胞和颗粒细胞加速凋亡，以致卵泡闭锁增多，导致卵巢储备减少，故此实验结果中，可见模型组较空白组的原始卵泡数量及生长卵泡数量显著下降,而且模型组中卵巢颗粒细胞凋亡率，较无接受VCD的空白组明显升高，说明此次DOR动物模型造模成功。

3.3　七子益肾理冲汤对各级卵泡数量及卵巢颗粒细胞凋亡的影响

肖承悰教授在临床上接诊了大量年龄高、卵巢储蓄功能低下但又想生育的患者，肖教授认为卵巢储蓄功能低下，其主要病机是肾虚冲血不足、血海空虚，而临床上亦以肾虚血瘀证最为多见 ，故以“肾主生殖”基础理论为指导，以补肾活血为法，运用益肾填精的中药，从整体对女性“下丘脑—垂体—卵巢—子宫生殖轴”进行调理，并用补血养肝之药物调理冲脉，使血海充盈而经调，终总结经验而独创七子益肾理冲汤[6-7]。七子益肾理冲汤中“七子”，启发于五子衍宗丸，“七子”所指是中药材：女贞子、枸杞子、菟丝子、沙苑子、覆盆子、香附(子) 、桑椹(子)，主要为补益肾中之肾精及肾气，精为阴，气为阳，《素问·四气调神大论》曰：“阳气根于阴，阴气根于阳。无阴则阳无以生，无阳则阴无以化。” 故七子益肾理冲汤之立法，在于肾中阴阳并补，使肾中阴阳互根互长，以期阳中有阴，阴中有阳，以奏益肾之功。此方基于“七子”，加上川续断、桑寄生、巴戟天，能补肾助阳兼安胎，熟地黄、白芍、黄精、黄芪，能补气养血，滋阴柔肝，全方补肾活血并用，补益肾中精气同时注重活血养肝，调理冲脉血海，其组方合理，配伍巧妙，用药精良。

踢鸽子的人走开了，但那位妇人追上他，说：“你叫什么名字？家住哪儿？我要去告发你。”那男子恼恨地说：“别在这儿把鸡毛当令箭。”她说：“我想你把一只可怜的小鸟当作鸡毛吧？”“嗨，不是令箭，凶杀不是令箭。”那两个少年中的一个双手插在外衣的口袋里，站在那里咧开嘴笑笑说。他的朋友机灵地接口说：“你说得不错，鸡毛是凶杀，但令箭不是凶杀。”“说得好，”第一个少年说，“鸽子什么时候才能成为令箭呢，只有在它成为鸡毛的时候。”（2014：406）

低磷处理下，各基因型苦荞幼苗根系的MDA含量显著升高(P < 0.05)，不耐低磷苦荞MDA含量增幅大于耐低磷苦荞(表3)。另外，两个低磷胁迫下，根系MDA含量增幅最小的品种分别为‘迪庆1号’(P2)和‘晋荞4号’(P3)。表明耐低磷苦荞品种的MDA积累量更低，膜脂损害程度更小。

本实验通过应用统计各级卵泡及黄体数量、TUNEL法检测卵巢颗粒细胞凋亡率，以明确七子益肾理冲汤抑制模型大鼠卵巢内卵泡颗粒细胞的凋亡、保留原始卵泡储备、减缓卵泡闭锁的效果，正向调节卵泡的正常发育。实验结果中，模型组中卵巢颗粒细胞凋亡率，较无接受VCD的空白组明显升高，而DOR大鼠分别经中西药治疗后，西药组、中药中剂量组及高剂量组之颗粒细胞凋亡率均较模型组有大幅度下降，虽仍未恢复到空白组的正常水平，但说明中西药均能在某种程度上达到抑制凋亡机制的作用；而且西药组及中药高剂量组的原始卵泡数量与空白组比较则无显著差异，说明七子益肾理冲汤高剂量、DHEA可能阻止卵巢原始卵泡储备的损耗。总结本实验，发现七子益肾理冲汤具有可能抑制卵巢颗粒细胞凋亡，以调节卵泡发育，达到保护卵巢原始卵泡储备及改善卵巢储备功能的作用。

参考文献

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[2]　Vasjiuo TE, Tapanainen JS. Apoptosis in the human ovary[J].Reprod Biomed Online,2003,6:24-35.

[3]　Perez GI, Maravei DV, Trbvich AM, et al. Identification of potassium-dependent and independent components of the apoptotic machinery in mouse ovarian germ cell and granulose cells[J]. Biol Reprod ,2002 , 63:1358-1379.

[4]　张丽娜，郑锦，刘特，等.卵巢早衰的动物实验研究进展 [J].辽宁中医杂志,2015,42(3):665-667.

[5]　Patricia BH, Patrick JD, Xiaomin H. Ovarian Toxicity of 4-Vinylcyclohexene Diepoxide: A Mechanistic Mode [J]. Toxicologic Pathology, 2001, 29(1): 91-99.

[6]　吴丽婷.七子益肾理冲汤治疗肝肾阴虚型卵巢早衰临床疗效观察[D]．北京：北京中医药大学，2017．

[7]　吴丽婷，石玥，刘雁峰.肖承悰治疗卵巢早衰经验[J]. 中医杂志,2017, 8 (2):108-110.