忍冬(Lonicera japonica Thunb)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)常绿藤木植物，是我国传统中药. 忍冬叶为忍冬的干燥叶片. 古代曾记载“花叶同效”；明朝李时珍也记录“忍冬茎叶及花功用皆同”[1]. 现代药理学研究发现，忍冬叶的药理活性与花相当，甚至部分活性优于花[2].

忍冬叶含有很多与花相似的活性成分，如黄酮类、有机酸类、环烯醚萜类等[3-5]，具有清热、抗菌消炎、抗氧化等药理活性[6-8]，而忍冬叶成分与品种、原料产地、生长环境等都有很大关系[9-12]. 不同生长期忍冬叶中活性成分的含量可能存在差异，所以对不同生长期的忍冬叶中活性成分的研究十分必要.

目前对忍冬的研究主要集中在花，很少系统地研究忍冬叶. 为了综合评价忍冬叶质量，本文作者对不同生长期的忍冬叶中总黄酮、挥发油和9种活性成分(绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、木犀草素和槲皮素)的含量进行研究，并以大肠杆菌、β-内酰胺酶大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、β-内酰胺酶阳性金黄色葡萄球菌为指示菌，研究了金银花叶抑菌活性，为忍冬叶的综合开发利用提供理论基础和依据.

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪Aglient 1200系列(美国安捷伦科技公司)，四元泵G1311 A，自动进样器，二极管阵列检测器，色谱柱：COSMOSIL5 C18-PAQ(4.6×250 mm，5 μm)；紫外可见分光光度计(TU-1900)；索式提取器(洛玻仪器厂)；电子分析天平(北京赛多利斯公司)；旋转蒸发器(郑州长城科工贸有限公司)；Agilent 7890A气相系统；Agilent 7000三重四极杆质谱仪，Agilent 7693自动进样器；洁净工作台(苏净安泰公司)；恒温培养箱；立式压力蒸汽灭菌器(DHG-914385-Ⅲ).

1.2 试剂与药材

对照品：新绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷(四川省维克奇生物科技有限公司)；芦丁(Aladdin-阿拉丁试剂(上海)有限公司)，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(本实验室自制，纯度≥98%)[13]；木犀草素、绿原酸、咖啡酸、槲皮素(中国药品生物制品检定所)；石油醚、乙醚和甲醇(天津市四友精细化学品有限公司)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为AR级，水为二次蒸馏水；培养基Mueller-Hinton Agar(BR，生化试剂)；Nutrient Broth(BR，生化试剂).

金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus，SA)ATCC25923(购于上海天呈生物信息有限公司)，β-内酰胺酶阳性金黄色葡萄球菌(Extended spectrum β-Lactamases Staphlococcus aureus，ESBLs-SA)，大肠杆菌(Escherichia Coli，EC)，β-内酰胺酶大肠杆菌(Extended spectrum β-Lactamases Escherichia Coli，ESBL-EC)均由河南大学附属淮河医院提供.

忍冬叶(2013-07～2014-06)采于河南大学药用植物园内，经河南大学药学院李钦教授鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬的叶.

2 实验方法

2.1 忍冬叶中总黄酮含量的测定

2.1.1 供试品溶液的制备

将忍冬叶干燥至恒重，粉碎过60目筛. 精密称取1 g样品粉末，置于锥形瓶中，加入10 mL乙醚封口静置12 h，得挥发油提取物，置于冰箱密封保存备用.

将忍冬叶样品置于40 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛. 精密称取样品2 g(平行三份)，置索氏提取器中，加120 mL石油醚进行脱脂，到无色即可；脱脂粉末晾干后用100 mL 80%甲醇(体积比)，在80 ℃下回流提取3次，每次3 h，提取结束后合并3次甲醇提取液，浓缩至干，用甲醇定容到50 mL容量瓶中，作为供试品溶液，备用. 进样前用0.45 μm有机滤膜过滤.

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取10 mg芦丁对照品，用甲醇溶解，定容至50 mL的容量瓶中，配成0.2 g·L-1的芦丁对照品溶液.

2.1.3 显色剂的配置

用蒸馏水分别配制10% 的Al(NO3)3溶液、5% 的NaNO2溶液和4% 的NaOH溶液，备用.

2.2 不同生长期忍冬叶中挥发油成分的测定

2.2.1 挥发油的提取

村、组山洪灾害防御工作组负责本村内山洪灾害简易雨量和水位观测、预警，并做好记录、上报，组织人员转移、安置和抢险等工作。参与本村地域内危险区的日常巡查，一旦遇到危险情况，提前预警，及时报告，并组织受威胁区群众撤离转移，配合各级政府部门做好自救、互救、安置工作。配合上级有关部门完成辖区山洪灾害防御年度工作总结。

近年来,输卵管妊娠的介入治疗具有安全、有效、不良反应少,可保存输卵管等优势。主要适用于输卵管妊娠未破裂者,尤其适用于要求保留生育功能的妇女。介入治疗异位妊娠的常用方式分两种,即经阴道输卵管胚囊内注射和经子宫动脉内插管灌注术。较常使用的药物为甲氨蝶呤、5- 氟尿嘧啶,由 于为局部用药,所以对全身影响较小,且杀胚率高[6]。有研究表明放射性血管介入治疗与腹腔镜手术治疗异位妊娠治疗成功率、完成手术后血B—h OG降至50%时间以及完成手术后血13一hCG降至正常时间几方面无显著差异(P>0.05)[7]。

2.2.2 气相色谱-质谱联用分析

将上述样品按一下条件进行气相色谱-质谱联用分析.

气相色谱条件：进样量：5 μL；分流进样，分流比：10∶1；载气:高纯氦气，进样口温度：250 ℃；流速：1.0 mL/min；采用程序升温方式：初始温度：100 ℃；初始时间：0.2 min；以10 ℃·min-1速率由100 ℃升至280 ℃，保持30 min. 总运行时间44 min.

质谱条件：电离方式：EI；电子能量：70 eV；传输线温度：250 ℃；离子源温度：250 ℃；电离电压：70 eV；扫描质量范围：30～650 amu.

2.3 忍冬叶中9种活性成分的动态变化

2.3.1 供试品溶液的制备

制备方法同2.1.1.

“不忘初心、砥砺前行、脚踏实地、实现目标”，自2009年公司改制至今，王致和食品有限公司已经历经十年的努力拼搏，十年艰苦卓绝奋斗成绩斐然。

3.1.2 标准曲线的绘制

化妆土在陶瓷装饰艺术作品中的另一个应用，就是实现装饰彩绘效果。一般而言，陶瓷装饰艺术品中的彩绘是以各种颜料的应用为主，进行手绘实现的。化妆土本身就是陶土的一种，能够在高温下仍保持稳定的质地，彩色的化妆土用于陶瓷装饰艺术的彩绘中，平衡了不同颜料产生的着色问题，统一了陶土的质地，使彩绘图案在高温下显色稳定，质地均衡；并且，彩色化妆土能够实现一件陶瓷装饰作品的多次上色，避免色彩重叠造成的混色情况。目前，开发彩色化妆土，丰富彩色化妆土的种类以及相应的工具，是陶瓷装饰艺术发展中的热点之一。

2.4 不同生长期忍冬叶抗菌活性

2.4.1 供试品的制备

我们以Windows2008Server 为服务器系统和Apache为平台，MYSQL为数据库系统,基于PHP:Hypertext Preprocessor的动态网页技术开发了一个智能室内环境检测物联网平台。平台设计可以由Socket API通信接口、系统配置、远程监控、规则管理、故障日志、分析模组等功能，初期为便于展现尽量简化设计。授权用户登录后只能各自查看各自居室内的情况，并根据用户的授权与否决定是否展现于大数据分析处理平台。

(1)样品提取方法同2.1.1，减压浓缩至干后，用灭菌水配成浓度为1 g/mL的溶液，作为各样品溶液.

c.重复性实验

2013年11月20日，经国务院同意，中国人民银行等十一部委联合下发了《云南省 广西壮族自治区建设沿边金融综合改革试验区总体方案》。5年来，全省建设沿边金融综合改革试验区领导小组紧扣国家“一带一路”建设，以昆明区域性金融服务中心建设为抓手，加快沿边开发开放经济带发展，为人民币“走出去”和促进全省经济跨越发展奠定了良好基础。

我国的环境监测工作进行到今天，还有一个亟待解决的问题就是对于很多及其隐蔽的环境问题无法及时辨识，这个情况是由于我国监测系统的警报系统工作效率低下。为了可以及时辨别环境问题，需要从员工和技术两方面对其进行完善。首先，每个员工都应该对自己的职责进行明确，单位内部也应该定期对工作人员进行考核和培训，提高他们的专业性。其次，企业应该不断引进先进技术，适应时代发展。

2.4.2 抑菌圈的测定

在无菌工作台上将配制好的琼脂培养基灭菌后倒入平底培养皿中，然后在平皿上等距打孔，标记平皿，在每个孔里加入不同浓度的供试品，同时用灭菌水做空白对照. 用无菌移液枪移取已配好的菌液50 μL加入平皿中，用玻璃涂布棒将菌液涂抹均匀. 在37 ℃恒温培养箱内倒置培养24 h，观察菌落生长情况，测定抑菌圈直径. 每个样品重复3次. 所有操作均在无菌条件下进行.

3 结果与讨论

3.1 忍冬叶中总黄酮含量的测定

3.1.1 波长的确定

“把国防教育渗透到各科教学之中。根据不同学科、不同课文的知识点，把国防教育引入课堂教育激发学生的兴趣。如思品课、语文课教材中的一些课文，我们尽可能地把革命英雄主义教育贯穿在这类课文中。”程主任畅谈着国防校本课程的开发思路。

将对照品溶液和供试溶液在400～650 nm进行扫描，结果均在510 nm处有最大吸收值，故检测波长为510 nm.

(2)琼脂培养基的制备(按说明制备即可).

2.3.2 色谱条件

绘制的标准曲线见图1，回归方程为：Y=0.003 29+0.012 28X，r=0.999 5. 芦丁浓度在10～70 mg·L-1范围内线性关系良好.

  

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standardcurves of rutin

3.1.3 精密度、稳定性、重复性、加标回收率试验

新一代的图书馆服务系统需要做到以下几点：在馆藏方面更加注重对其内容的语义分析和利用；在读者服务方面更加强调对读者的全方位服务，通过数据服务平台和用户管理实现对读者阅读行为全方位画像和个性化服务，并且能够支撑同读者社交生活的对接；在功能方面更加强调以平台化的思想将资源和功能对外开放，方便读者从更多的角度和更深的层次对图书馆资源进行利用。

我们可以看到Alice和Bob的隐私策略是冲突的，根据之前策略冲突的处理方法，最终Ted得到的消息中，“教师”由“社会角色”代替，定位中的“江宁区”由“南京”代替，所以最后Ted在他自己的移动在线社交应用上看到的Alice发布的消息内容是这样的：今天天气很好，我跟我的好朋友Bob一起去了幼儿园看望小朋友，因为Bob是社会角色，所以他跟孩子们相处的很融洽。消息最后有一个定位是南京。这样就很好的保护了Alice跟Bob的隐私。

a.精密度实验

参照课题组前期工作[14],采用COSMOSIL5C18-PAQ(4.6×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.5%醋酸(B)，梯度洗脱(0～10 min，12%～20% A；10～20 min，20% A；20～45 min，20%～30% A)，流速1 mL·min-1. 检测波长λ=327 nm；温度t=25 ℃；进样量：10 μL.

精密吸取供试品溶液0.2 mL，在510 nm处，以空白溶液为参比，连续测定5次，RSD=1.42%，表明仪器精密度良好.

b.稳定性实验

精密吸取供试溶液0.2 mL，在510 nm处，以空白溶液为参比，每隔10 min测定1次吸光度，测定在1 h内的吸光度变化，RSD=1.79%，表明样品的稳定性良好.

2) 在小港口城市平均投资回报率低下时，小港口城市会积极投资港口，从而诱发港口投资竞争。要想避免这种现象，只能提高小港口城市的平均投资回报率，使小港口城市有更多的投资领域，通过发展其他产业发展城市经济。

选择MRM对金芪降糖片提取液、大鼠进药后血样进行鉴定，通过与空白血样和对照品进行对比，在给药后的大鼠血样中检测到16种原形产物。结果表明，在MRM模式下，血清中内源性物质均没有干扰测定。原形产物分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、木兰花碱、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芪甲苷，MRM模式下各组分的提取离子流质谱图见图3。根据图3总结各组分的主要碎片离子及其归属见表2。

取忍冬叶粉末(平行5份)，按2.1.1方法制成供试品溶液，在510 nm下测定吸光值，计算RSD=2.13%，表明本实验的重复性较好.

d.加标回收率试验

精密吸取忍冬叶供试品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入对照品溶液0.5 mL，加入5% NaNO2溶液0.5 mL，放置5 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，放置5 min，再加入4% NaOH溶液4.0 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，以空白溶液作为参比，在510 nm处测吸光度. 测得总黄酮的平均回收率为98.32%，RSD为1.21%(n=5).

3.1.4 样品的测定

测定不同生长期忍冬叶中总黄酮的含量，结果见表1. 并与前两年(2011-2013年)忍冬叶总黄酮含量做对比[15]，结果见图2.

  

图2 连续三年忍冬叶总黄酮动态变化Fig.2 Dynamic variations of flavonoids in leaves of Lonicera japonica Thunb for three years

 

表1 不同生长期的忍冬叶中总黄酮的含量(n=3)Table 1 Content of flavonoids in leaves of Lonicera japonica Thunb at different harvest time(n=3)

  

忍冬叶采摘时期含量/%RSD/%2014-015.401.632014-024.861.342014-035.990.502014-042.891.912014-051.762.032014-066.680.672013-076.560.782013-083.781.342013-093.540.892013-102.691.492013-113.950.782013-126.020.46

在不同生长期的忍冬叶中总黄酮含量测定结果中发现，六月份(6.68%)和七月份(6.56%)总黄酮含量较高. 黄酮类化合物含量变化与其在植物体内的调控规律和代谢密切相关[16]，且受光照影响较大，有研究[17-18]发现太阳照射可以使黄酮含量增加，其在紫外辐射充足的夏季比紫外辐射较少的春季高2～3倍；适当延长光照时间也可以促进黄酮含量的提高，其积累与日照时数呈正相关. 另外适当的低温也有利于黄酮的积累，高温会抑制酶活性，含量反而会降低[19-20]；且中度干旱或重度干旱下，更适宜黄酮含量的积累[21]. 对于河南省而言，6月～10月是一年中紫外线辐射最强的一段时间，理论上有利于黄酮类物质在植物体内积累，但8月份的温度较高反而抑制了黄酮类物质合成过程中一些关键酶的活性，12月份降雨量少，比较干旱，所以忍冬叶中总黄酮含量在6月份、7月份和12月份相对较高. 且连续三年各月份忍冬叶总黄酮含量的动态变化趋势几乎一致，为确定忍冬叶最佳采摘期提供理论依据.

3.2 不同生长期忍冬叶中挥发油成分的测定

将所有样品的挥发油提取液分别按照上述试验条件进行GC-MS分析，测得其成分分析结果见表2.

 

表2 不同生长期的忍冬叶挥发油成分鉴定结果Table 2 Volatile oil components among Lonicera japonica Thunb leaves in different harvest time

  

化合物相对含量/%1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月烃类/%73.4276.6552.3451.9683.1566.0775.3078.5075.7776.6659.5762.01醇酮类/%5.373.634.2818.205.389.3518.653.093.728.677.432.36酸类/%19.3312.3626.3116.865.7510.641.5612.289.1412.0823.4715.14萜类/%05.57012.571.8315.360.3502.0702.235.94脂类/%0.7000.22000.780.761.240.3300.520衍生物类/%0.391.805.440.203.903.841.030.841.072.113.276.95

由挥发油成分实验数据可得，7月份的种类最多，有22种，6月份和11月份仅次于7月份均有21种，3月份的最少仅有13种. 不同生长期的忍冬叶中挥发油成分存在一定的差异，5月份的烃类化合物总量最高，为83.15%；6月份的叶子中萜类成分含量最高是15.36%，其次是4月份(12.57%).

3.3 忍冬叶中9种活性成分的动态变化

分别测得不同生长期忍冬叶中绿原酸、咖啡酸、新绿原酸、木犀草素、异绿原酸C、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和木犀草苷的含量，结果见表3.

 

表3 不同生长期忍冬叶中9种成分的含量(n=3)Table 3 9 analytes in Lonicera japonica Thunb leaves in different harvest time

  

化合物含量/(mg·g-1)(RSD/%)1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月绿原酸18.15(1.63)34.66(1.85)27.65(0.61)12.40(1.55)3.26(2.24)17.75(0.28)19.75(0.60)4.88(0.18)7.42(1.34)7.42(1.66)14.08(1.27)26.48(1.62)咖啡酸0.21(1.96)0.039(1.55)0.021(0.90)0.18(2.38)-0.011(2.81)0.03(1.97)-0.019(0.48)0.015(0.26)0.01(3.29)0.69(1.54)新绿原酸0.33(0.45)0.69(0.015)0.41(0.017)0.10(0.029)0.05(0.031)0.55(0.016)0.57(0.015)0.19(0.25)0.15(0.12)0.16(0.027)0.35(0.010)0.59(0.11)异绿原酸C30.06(1.26)60.54(1.09)38.87(0.57)2.75(1.27)7.96(3.17)140.47(3.42)113.05(0.98)25.21(0.61)34.38(0.40)15.44(1.84)21.00(3.47)120.20(2.70)芦丁5.88(0.22)6.90(0.26)4.54(0.013)7.33(0.043)5.93(0.014)13.82(0.010)11.27(0.039)11.27(0.10)13.06(0.040)7.78(0.019)7.31(0.023)12.22(0.048)木犀草素0.09(1.35)0.083(2.48)0.086(0.55)0.069(2.98)0.074(2.61)0.17(1.87)0.11(0.91)0.16(2.28)0.18(1.09)0.14(2.54)0.088(1.72)0.12(2.19)木犀草苷4.49(0.88)7.20(1.48)6.20(2.70)3.29(2.08)0.92(1.76)1.80(1.21)1.94(1.06)1.27(1.03)1.55(1.32)1.49(1.63)2.27(1.82)7.78(1.26)金丝桃苷1.97(1.56)2.36(1.85)1.83(0.64)------0.90(2.46)1.33(1.26)2.20(2.02)槲皮素------------

通过对不同生长期忍冬叶中9种活性成分研究发现，异绿原酸C和绿原酸在不同生长期的含量都相对较高，其次是木犀草苷和芦丁. 金丝桃苷仅存在于1、2、3、10、11、12月份，且含量较低，可能由多种因素决定，具体作用机制尚未报道. 各个生长期均未检出槲皮素.

3.4 不同生长期忍冬叶抗菌活性

各个样品对SA、ESBLs-SA、EC、ESBL-EC的抑菌效果如表4.

 

表4 各样品对SA、ESBLs-SA、EC、ESBL-EC的抑菌圈Table 4 Bacteriostatic results of inhibition zone

  

样品浓度g/mL抑菌圈(mm)SARSD/%ESBLs-SARSD/%ECESBL-EC11111.31100.92--21120.2190.34--3190.45110.69--41111.12110.81--51100.39100.43--61130.78140.74--71130.64120.97--81101.61121.36--91100.538.50.44--101101.32110.83--111110.58100.62--121122.26120.37--

由不同生长期忍冬叶的抑菌活性可知，忍冬叶对革兰氏阳性菌SA、ESBLs-SA有较好的抑制效果，对革兰氏阴性菌EC、ESBL-EC抗菌效果不明显. 有研究证实忍冬对革兰氏阳性菌的抑制效果比革兰氏阴性菌的效果好[22-24]. 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖构成，而忍冬中的黄酮类物质可以溶解肽聚糖成分，因而可溶解细胞壁；而革兰氏阴性菌的细胞壁主要是脂类成分，忍冬中的抗菌成分对其溶解性较困难，所以对革兰氏阴性菌的抑制效果相对较差.

不同生长期的忍冬叶提取物的抑菌效果差异较大，其中对于SA细菌，6月份和7月份忍冬叶的抑菌效果相当(均为13 mm)，2月份和12月份忍冬叶的抑菌效果(12 mm)与花相当，但略低于前者，3月份忍冬叶对SA的抑菌效果最弱；对于ESBLs-SA细菌，7月份、8月份和12月份的抑菌圈均为12 mm，仅次于6月份(14 mm)，9月份忍冬叶的抑菌效果最弱(仅有8.5 mm). 武雪芬等[25]研究得出绿原酸和粗黄酮对细菌有很强的抑制作用，本文研究表明6月份的忍冬叶中两者的含量都较高，进一步从理论上解释了6月份忍冬叶抑菌活性较强原因.

积极开展水土保持知识进校园活动，针对中小学生开展了新一轮水土保持知识教育活动。在西宁市教委的支持下，2013年4月19日西宁市黄河路小学组织200余名师生在长岭水土保持科技示范园区开展了“携手保护生态，共建绿色家园”的主题活动。5月31日西宁市南川西路小学近1400名少年儿童到西宁长岭水土保持科技示范园开展水土保持科普教育户外实践活动。同时编印了中小学《水土保持科普教育知识读本》，在西宁市、海东市、黄南州等地中小学发放5000余册。面向生产建设单位、水土保持重点地区印发了《水土保持科普读本》1000余册。同时制作了《青海小流域综合治理纪实》《生态公园、绿色长岭》等两部专题宣传片。

4 结论

从测定结果来看，不同生长期的忍冬叶多种活性成分的含量差异较大.

6月份的忍冬叶中绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、异绿原酸C、芦丁、木犀草苷、木犀草素以及总黄酮和挥发性成分的含量相对较高，其次是7月份和12月份，且6月份忍冬叶抑菌活性最优. 因此可以确定忍冬叶的最佳采摘期为6月份，对其利用不仅可以变废为宝，还可以扩大忍冬药源，增加农业附加值，以期实现忍冬叶可利用化.

绿原酸和木犀草苷是忍冬的质量控制指标[26]. 由于黄酮类化合物是忍冬抑菌有效成分之一，在参与癌症、免疫缺陷以及更年期综合症等疑难疾病的控制中起着重要作用；挥发油是忍冬药用部分的精华，也有重要的药理、药效作用. 而忍冬叶也含有丰富的黄酮类、挥发油等活性成分. 因此黄酮类化合物和挥发油的含量不仅可作为评价忍冬的质量标准，也可综合评价忍冬叶的质量[27]. 且忍冬叶挥发油便于加工，已成为多种产品的生产原料，在部分产品中，可用忍冬叶挥发油替代忍冬花挥发油来降低成本，以实现忍冬叶的潜在利用价值. 本文为忍冬叶多指标控制质量的研究提供了思路方向和技术支撑，并为忍冬叶综合开发利用提供理论参考.

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