骨骼的生长与发育是依赖成骨细胞（osteoblast，OB）的骨重建功能和破骨细胞（osteoclast，OC）的骨吸收功能来维持的，当骨重建与骨吸收之间的动态平衡在外源因素的干扰下发生破坏，就会引发骨代谢的紊乱，最终导致骨骼发生病理性变化。

特殊的地质环境使贵州部分地区环境中蓄积了大量的氟和砷，由氟砷联合作用导致的一系列疾病称为“氟砷综合征”，氟砷中毒能够引起人体多个组织器官的病理性变化，其中骨骼是氟砷联合中毒的重要靶器官之一，本课题组前期实验研究结果［1］表明，氟砷联合作用能够改变大鼠骨组织基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、核转录因子-kβ受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factorkβ ligand，RANKL）蛋白含量；而MMP-9、RANKL蛋白含量的改变提示了大鼠骨组织OC骨吸收功能可能发生了变化［2-3］。因此，本研究拟通过对大鼠进行氟、砷及氟砷联合染毒，对实验大鼠OC骨吸收能力相关指标如抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrateresistant acid phosphatase 5b，TRACP-5b）、Ⅰ型胶原吡啶交联终肽（pyridinoline cross linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、1，25二羟基维生素D3［1，25-Dihydroxy vitamin D3，1，25（OH）2D3］进行检测，通过观察TRACP-5b、ICTP及OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量的变化探讨氟、砷及氟砷联合对大鼠OC骨吸收能力的毒性影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超净工作台（越平科学仪器有限公司，中国），纯水仪（Nikon，日本），高速低温离心机（Sigma，美国），超级酶联免疫检测仪（Thermo，美国），氟化钠（NaF）、亚砷酸钠（NaAsO2，山东西亚试剂公司，中国），大鼠ICTP ELISA试剂盒、大鼠TRACP-5b ELISA试剂盒、大鼠OPG ELISA试剂盒、大鼠PGE2 ELISA试剂盒、大鼠1，25（OH）2D3 ELISA试剂盒（上海江莱生物公司，中国）。

1.2 动物的分组与染毒

取8周龄、清洁级SD大鼠54只，体重为（109.71±10.52）g［许可证号：SCXK（渝）2007-0003］，按析因设计方法将SD大鼠随机分成9组，每组6只，雌雄各半。分别以NaF（5、20 mg/kg，按体重计，后同）和NaAsO2（2.5、10 mg/kg）进行单独或联合染毒。9个实验组命名（缩写）为：对照组（F0As0）、低氟组（F5）、高氟组（F20）、低砷组（As2.5）、高砷组（As10）、低氟低砷组（F5As2.5）、低氟高砷组（F5As10）、高氟低砷组（F20As2.5）、高氟高砷组（F20As10）。NaF和NaAsO2用去离子水溶解，按上述分组，分别予以灌胃。动物自由摄取饲料、自由饮水，自动控制昼夜循环（12/12 h），室温（22±1）℃。每周染毒5 d，连续灌胃染毒26周。每周称重一次，调节并维持给药量；每周调换笼位一次。

信息化调查既是犯罪调查领域的一场信息化变革也是监察体制改革的自身要求，这一战略需要以常态化工作机制为载体才能充分发挥其效用，对于信息化调查来说，除了需要建设软件硬件等方面之外，建立完善一套信息引导犯罪调查的工作机制至关重要。信息引导犯罪调查工作机制是一套成体系的科学机制，从获取线索到调查终结都有信息引导犯罪调查机制的作用，还要勇于突破之前职务犯罪侦查原有“由人到案”和“由供到证”的习惯性做法。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 血清中TRACP-5b、ICTP蛋白含量的检测 ELISA法检测血清中TRACP-5b和ICTP含量。

氟 对 大 鼠TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量的效应均为主效应（P < 0.05）；而砷的主效应不明显（P > 0.05）；氟砷联合染毒对TRACP-5b、ICTP蛋白含量的影响存在交互作用（P < 0.05），对OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量交互作用无统计学意义。见表2。

1.4 统计学分析

高氟组OPG、1，25（OH）2D3含量高于低氟组，差异有统计学意义（P < 0.05）；染砷组各指标变化不明显，高砷组和低砷组组间差异均无统计学意义（P > 0.05）。与低氟低砷组相比，低氟高砷组的OPG、1，25（OH）2D3含量变化不明显（P > 0.05），但PGE2蛋白含量降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与高氟低砷组相比，高氟高砷组的1，25（OH）2D3含量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与低氟低砷组相比，高氟低砷组的OPG、1，25（OH）2D3含量增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；与低氟高砷组相比，高氟高砷组的OPG、PGE2含量增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2 结果

2.1 各染毒组大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量的变化

氟与TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1，25（OH）2D3的含量均为正相关关系（均P < 0.05）；砷与TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1，25（OH）2D3相关性均无统计学意义（均P > 0.05）。见表3。

因此，在录取分数低、学生文化基础较差、接受能力参差不齐、学习目的不明确、学习动力不足的新形势下，高职教育如何“以学生为中心、以学生为主体”，在职业技术课教学中注重学生综合技能的培养，是高职教育教学改革的必然趋势[2]。

2.2 各染毒组大鼠骨组织中OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量的变化

Excel建立数据库，SPSS 17.0统计软件录入数据并对实验数据进行正态性检验、方差齐性检验、单因素方差分析、偏相关分析、交互作用分析。实验结果均以均数±标准差表示，经检验，数据符合正态分布；对数据进行方差齐性检验，方差齐时，组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时，采用Tamhane’s T2法比较；采用析因设计方差分析判断有无交互作用，并分析两者交互作用类型；以氟砷互为控制变量进行氟砷与各指标的偏相关分析。检验水准α=0.05。

 

表1 各染毒组ICTP、TRACP-5b、OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量的变化（n=6，±s，ng/L）Table 1 Changes of ICTP，TRACP-5b，OPG，PGE2，and 1，25（OH）2D3 levels in each group

  

1，25二羟基维生素D3 1，25（OH）2D3对照组（F0As0） 1.352±0.025 2.942±0.078 12.278±0.220 1.352±0.025 9.582±0.363低氟组（5 mg/kg，F5） 1.392±0.028 3.048±0.092a 12.918±0.685 1.392±0.058 10.415±0.609a高氟组（20 mg/kg，F20） 1.427±0.026a 3.202±0.142ab 14.087±0.797ab 1.427±0.026a 11.915±0.931ab低砷组（2.5 mg/kg，As2.5） 1.363±0.027 2.965±0.115 12.366±0.465 1.363±0.027 9.695±0.566bc组别GroupⅠ型胶原吡啶交联终肽ICTP抗酒石酸酸性磷酸酶5b TRACP-5b骨保护素OPG前列腺素E2 PGE2

 

续表1

  

［注］a：与对照组相比，P < 0.05；b：与低氟组相比，P < 0.05；c：与高氟组相比，P < 0.05；d：与低砷组相比，P < 0.05；e：与高砷组相比，P < 0.05；f：与低氟低砷组相比，P < 0.05；g：与低氟高砷组相比，P < 0.05；h：与高氟低砷组相比，P < 0.05。［Note］a：Compared with the control group，P < 0.05；b：Compared with the low fluoride group，P < 0.05；c：Compared with the high fluoride group，P < 0.05；d：Compared with the low arsenic group，P < 0.05；e：Compared with the high arsenic group，P < 0.05；f：Compared with low fluoride and low arsenic group，P < 0.05；g：Compared with low fluoride and high arsenic group，P < 0.05；h：Compared with high fluoride and low arsenic group，P < 0.05.

 

1，25二羟基维生素D3 1，25（OH）2D3高砷组（10 mg/kg，As10） 1.382±0.045 2.953±0.095 12.448±0.298 1.382±0.045 9.537±0.732低氟低砷组（5 mg/kg+2.5 mg/kg，F5As2.5） 1.408±0.041ad 3.043±0.098 13.013±0.391a 1.442±0.034ad 10.422±0.602ad低氟高砷组（5 mg/kg+10 mg/kg，F5As10） 1.425±0.038ae 3.098±0.085ae 13.124±0.383ae 1.345±0.080f 11.005±0.792ae高氟低砷组（20 mg/kg+2.5 mg/kg，F20As2.5） 1.442±0.034ad 3.280±0.095abdfg 14.268±0.847adf 1.425±0.038adg 12.082±0.860adf高氟高砷组（20 mg/kg+10 mg/kg，F20As10） 1.345±0.042cgh 3.053±0.084ch 14.365±0.811aeg 1.408±0.041aeg 10.567±0.695aceh组别GroupⅠ型胶原吡啶交联终肽ICTP抗酒石酸酸性磷酸酶5b TRACP-5b骨保护素OPG前列腺素E2 PGE2

2.3 氟砷联合染毒对大鼠TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1，25（OH）2D3水平的交互作用

1.3.2 骨组织中OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量的检测 称取0.3 g右侧股骨组织，加入少量液氮，在研钵中迅速将骨组织碾碎至粉末状；将骨组织粉末转入2 mL Eppendorf管中，加入1.2 mL PBS缓冲液（pH=7.4），充分振荡混匀，2000×g、4℃，离心20 min。仔细收集上清液。获取骨骼匀浆上清液后采用ELISA法检测骨骼中OPG、PGE2、1，25（OH）2D3含量。

正如我们在第一节的最后所总结的一样，推荐系统中的各种算法也具备算法的基本条件，但它们的特别之处在于它们是在通过一个特定的矩阵来分析各个用户的行为数据而得到的一些相关的统计结果(如下图所示)，这其实就是为什么推荐系统一般能够准确的得出一个人的喜好的背后原理所在。

 

表2 氟砷交互作用分析Table 2 Analysis of the interaction effect of fluoride and arsenic

  

染毒方式Exposure typeⅠ型胶原吡啶交联终肽ICTP 1，25二羟基维生素D3 1，25（OH）2D3 F P F P F P F P F P抗酒石酸酸性磷酸酶5b TRACP-5b骨保护素OPG前列腺素E2 PGE2氟（F） 8.188 0.001 24.560 0.000 47.100 0.000 9.031 0.001 3.114 0.044砷（As） 2.597 0.086 1.813 0.175 0.059 0.561 1.525 0.229 0.083 0.920氟+砷（F+As） 3.345 0.018 3.722 0.011 0.020 0.999 0.395 0.811 0.176 0.950

2.4 氟砷与TRACP-5b、ICTP、OPG、PGE2、1，25（OH）2D3的偏相关分析

染氟组ICTP、TRACP-5b蛋白含量在高氟组均高于对照组（P < 0.05）；与低氟组相比，高氟组TRACP-5b含量高于低氟组，差异有统计学意义（P < 0.05）。染砷组ICTP、TRACP-5b蛋白含量随着染砷剂量的增加，其变化均不明显（P > 0.05）。与低氟低砷组相比，低氟高砷组的ICTP、TRACP-5b蛋白含量变化不明显（P > 0.05）；与高氟低砷组相比，高氟高砷组的ICTP、TRACP-5b蛋白含量明显降低，差异有统计学意义（P <0.05）。与低氟低砷相比，高氟低砷组的TRACP-5b蛋白含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与低氟高砷组相比，高氟高砷组的ICTP蛋白含量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

再生混凝土(Recycled Aggregate Concrete，RAC)是指将废弃的混凝土经过机械破碎、清洗、分级后，按照一定的比例与级配混合，部分或者全部代替天然粗细骨料，再加入水泥、水等拌和而成的新型混凝土[1]。再生混凝土从根本上解决了废弃混凝土的处理问题，节约了天然骨料资源，具有显著的社会、经济和环境效益[2]。再生混凝土在破碎过程中，使得再生骨料棱角过多，针状再生骨料所占面积过大，并且破碎过程中产生大量的内部横向裂缝，使得再生混凝土强度降低[3]。

 

表3 氟砷的偏相关分析Table 3 Partial correlation analysis of fluoride and arsenic

  

［注］TRACP-5b为抗酒石酸酸性磷酸酶5b；ICTP为Ⅰ型胶原吡啶交联终肽；OPG为骨保护素；PGE2为前列腺素E2；1，25（OH）2D3为1，25二羟基维生素D3。［Note］TRACP-5b：tartrateresistant acid phosphatase 5b；ICTP：pyridinoline cross linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen；OPG：osteoprotegerin；PGE2：prostaglandin E2；1，25（OH）2D3：1，25-dihydroxy vitamin D3.

 

变量1 Variable 1变量2 Variable 2Partial correlation coefficient P 变量1 Variable 1偏相关系数变量2 Variable 2偏相关系数Partial correlation coefficient P氟（F） TRACP-5b 0.663 0.000 砷（As） TRACP-5b -0.113 0.421氟（F） ICTP 0.392 0.004 砷（As） ICTP -0.157 0.262氟（F） OPG 0.804 0.000 砷（As） OPG 0.132 0.350氟（F） PGE2 0.487 0.000 砷（As） PGE2 0.210 0.136氟（F） 1，25（OH）2D3 0.748 0.000 砷（As） 1，25（OH）2D3 0.192 0.168

3 讨论

ICTP是OC发生溶骨反应时，骨基质I型胶原蛋白在MMP介导下释放的一种交联降解产物［4］，以完整的免疫源性肽形式进入血液之中，不会进一步发生降解，是反映OC骨吸收速率的敏感指标。TRACP是OC溶酶体中一种特异性高表达的酶，血液中的TRACP-5b主要由骨组织的OC分泌，因此血液中的TRACP-5b蛋白含量可以反映骨组织中OC的含量。本研究偏相关分析结果表明，大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量均与氟呈正相关；且各染毒组ICTP、TRACP-5b蛋白含量的变化结果表明氟促进OC的分化，增加骨组织中OC的含量，加速OC对骨骼的降解速率。氟砷联合染毒结果显示，氟对ICTP、TRACP-5b蛋白含量均呈主效应作用，砷的主效应作用不明显；氟砷联合染毒对ICTP、TRACP-5b的影响表现出明显的交互作用，在氟砷联合染毒组中，染氟浓度在20 mg/kg时，与高氟低砷组相比，高氟高砷组的ICTP、TRACP-5b均降低，这一结果表明砷虽然并未对大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量表现出直接的毒性影响，却能通过抑制氟对大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量的促进作用，间接对大鼠血清中ICTP、TRACP-5b蛋白含量进行调控，因此高氟时氟、砷对ICTP、TRACP-5b的交互作用表现为拮抗作用。

OPG是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体家族中一个缺乏跨膜结构域的受体蛋白，主要分布在骨组织及免疫系统，是OC调控终末因子，其调控机制主要是凭借着高亲和性与核转录因子-kβ受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-kβ，RANK）竞争性结合，阻断RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞前体（osteoclast precursors，OCPs）向OC的分化［5］。本研究的偏相关分析结果显示，OPG在骨组织的蛋白含量与染氟浓度呈正相关；各染毒组OPG蛋白含量的变化结果表明OPG蛋白含量的变化与染砷浓度无明显相关性，氟起到主效应作用，氟砷联合作用不明显，提示了氟能促进大鼠骨组织OPG蛋白含量的升高。OPG作为OC的抑制因子，其含量变化通常与OC的含量及骨吸收能力呈负相关，但是在本研究中，从TRACP-5b、ICTP蛋白含量变化来看，大鼠骨组织OC含量及骨吸收能力并没有随着OPG含量的升高而降低。对于这一现象，可结合本课题组前期研究的一些结果来讨论，在本课题组前期研究［1］中观察到大鼠骨组织RANKL蛋白含量在各染毒组主要表现为升高；RANKL的升高抵消了OPG的升高对OC的抑制作用，这可能是本实验中OC骨吸收能力并没有随着OPG蛋白含量上升的原因之一。在本课题组前期研究中观察到RANKL蛋白含量在高氟浓度下随着染砷剂量的升高而逐渐降低；而在本实验中观察到OPG蛋白含量在高氟浓度下，并未随着染砷浓度的增加而变化，而前期研究发现［1］OPG/RANKL值在高氟高砷组高于高氟低砷组，这可能是氟、砷在F20As2.5、F20As10组对OC骨吸收能力表现为拮抗作用的机制之一。

1，25（OH）2D3是维生素D的主要活性代谢产物，与维生素D受体结合可以上调RANKL的表达［6］。PGE2属于前列腺素家族，研究指出，PGE2能够影响OC中MMP-9的表达，进而实现对MMPs家族的间接调控［7］。根据PGE2、1，25（OH）2D3在各染毒组含量的变化、偏相关分析结果可知，氟与PGE2、1，25（OH）2D3含量呈正相关关系，与染砷剂量无相关性。而PGE2、1，25（OH）2D3的升高可能是本课题组前期研究中观察到大鼠骨组织MMP-9、RANKL表达升高的原因之一；氟砷的交互作用结果显示，氟起到主效应作用，砷的主效应作用不明显，氟砷之间存在联合作用。氟砷联合染毒组，染氟浓度在5 mg/kg时，PGE2随着染砷剂量的增加而明显降低，而1，25（OH）2D3变化不明显；染氟浓度在20 mg/kg时，PGE2变化不明显，1，25（OH）2D3随着染砷剂量的增加而降低，这一结果提示了砷虽然不能直接影响大鼠骨组织PGE2、1，25（OH）2D3含量，却可以通过抑制氟的主效应作用，达到调控的目的，氟砷的联合毒性在F20As10组对PGE2、1，25（OH）2D3主要表现为拮抗作用。

综上所述，在本实验条件下，砷能抑制氟暴露对大鼠OC骨吸收功能的促进作用，氟砷之间主要表现为拮抗作用。砷可以在高氟浓度下协同氟对OPG的促进作用，抑制OC骨吸收能力，这可能是氟砷在高氟浓度下对OC骨吸收能力表现为拮抗作用的机制之一。PGE2、1，25（OH）2D3可能是氟砷对OC骨吸收功能进行调控的重要因子。

参考文献

［1］洪峰，郑冲，徐德淦，等.慢性氟砷联合暴露对大鼠骨骼Runx2及其下游相关因子的影响［J］.中华预防医学杂志，2013，47（9）：794-798.

［2］WUCHERPFENNIG A L，LI Y P，STETLER-STEVENSON W G，et al. Expression of 92 kD type IV collagenase/gelatinase B in human osteoclasts［J］. J Bone Miner Res，1994，9（4）：549-556.

［3］COLNOT C，THOMPSON Z，MICLAU T，et al. Altered fracture repair in the absence of MMP9［J］. Development，2003，130（17）：4123-4133.

［4］COLEMAN R，BROWN J，TERPOS E，et al. Bone markers and their prognostic value in metastatic bone disease：clinical evidence and future directions［J］. Cancer Treat Rev，2008，34（7）：629-639.

［5］GILLET C，SPRUYT D，RIGUTTO S，et al. Oleate abrogates palmitate-induced lipotoxicity and proinflammatory response in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and osteoblastic cells［J］. Endocrinology，2015，156（11）：4081-4093.

［6］LIEBEN L，CARMELIET G. Vitamin D signaling in osteocytes：effects on bone and mineral homeostasis［J］.Bone，2013，54（2）：237-243.

［7］庞显伦，杨健，秦昊.人工关节炎性介质对滑膜细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响［J］.中华实验外科杂志，2016，33（4）：1052-1054.