丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的疾病，呈全球流行，不同性别、年龄、种族、民族人群均对HCV易感，国外近几年研发的直接抗病毒药物(direct-acting antiviralagents,DAAs)在丙肝抗病毒领域取得了重大突破，使得丙肝的治疗出现了跨时代的变革，其在抗HCV过程中具有高持续病毒学应答率(SVR率)、广泛基因型谱、治疗周期短、不良反应发生率低、患者依从性好和禁忌证少等优点[1]。然而，随着DAAs药物在临床中的广泛应用，尤其是在单一应用DAAs药物治疗时，部分患者出现耐药相关突变(resistance associated variants，RAVs)[2]，而且在未经过任何抗病毒治疗的丙型肝炎患者体内也存在有针对DAAs的耐药突变株，即存在天然耐药突变[3]。目前DAAs药物根据其作用靶点不同可将其分为NS3/4A蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂和NS5B聚合酶抑制剂3类，其中NS5A抑制剂是目前DAAs中抗病毒效果最强的，但是耐药屏障相对较低[4]。国内外的一些研究报道指出，针对NS5A抑制剂的相关耐药突变位点主要是NS5A区域的N端24-93号位点，主要为24、28、30、31、32、58、92和93号等位点的氨基酸替换[5]，其中基因1a型常见的耐药位点突变为M28T/V、Q30H/E/R/K、L31M/V、P32L和Y93C/H/N等，而基因1b 型常见耐药位点突变是R30Q、L31M、P58S和Y93C/H/N，次级耐药位点为 L23F、R30Q、P58S等[6-9]。这些研究都不是基于大人群研究所得出的结果，且多为外国人群的研究，而RAVs 的存在会影响治疗的效果，由于种族、地域及HCV基因的不同，RAVs的发生率也存在很大的差异[10]。为了解广西地区基因1型的丙型肝炎人群中是否存在RAVs以及突变位点如何，本课题组对此进行了研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2013年5月至2017年11月在广西医科大学第一附属医院感染性疾病科门诊就诊的未经任何抗病毒治疗的基因1型丙型肝炎患者134例(基因1a型21例，基因1b型113例)的外周血血清及临床相关资料，所有患者均为广西籍，基因分型由武汉康圣达检验中心检测分型。134例患者中，男71例，女63例，平均(46.3±12.4)岁，谷丙转氨酶(ALT)为(77.2±60.8)U/L；谷草转氨酶(AST)为(67.8±59.1)U/L，HCV RNA为(6.7±2.9)IU/mL。慢性丙型肝炎诊断标准符合2012年《中国丙型病毒性肝炎医院感染防控指南》[11]，同时排除合并其他病毒性肝炎、艾滋病感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病的患者等。

1.2 HCV NS5A区基因扩增和测序 从每份样本中取血清200 mL，用北京全式金核酸RNA试剂盒提取HCV RNA，取6 μL HCV RNA用TIANScript Ⅱ RT Kit (KR107)试剂盒将其逆转录成cDNA；应用Premix TaqTM (LA TaqTM Version 2.0 plus dye) (RR903A Takara)试剂，巢式PCR方法扩增患者的NS5A区域，不同的基因型设计各自特定的引物序列进行扩增(具体引物序列见表1)，引物均由上海生工合成。第一轮PCR反应体系：以4 μL cDNA为模版、Premix TaqTM (LA TaqTM Version 2.0 plus dye) 12.5 μL、上下游引物F1、R1各1 μL，最后加ddH2O至总体系25 μL。第二轮巢式PCR扩增反应体系：以上述获得的第一轮PCR产物2 μL为模版、Premix TaqTM (LA TaqTM Version 2.0 plus dye) 12.5 μL，上下游引物F2、R2各1 μL，最后加ddH2O至总体系25 μL。PCR反应条件：基因1a型，第一轮扩增：94 ℃ 3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环，72 ℃ 10 min，最后保存在4 ℃。第二轮PCR巢式扩增：94 ℃ 3 min；94 ℃变性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环，72 ℃10 min，最后保存在4 ℃。基因1b型，第一轮扩增：94 ℃ 3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环，72 ℃ 10 min，最后保存在4 ℃。第二轮PCR巢式扩增：94 ℃ 3 min；94 ℃变性30 s，69 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环，72 ℃ 10 min，最后保存在4 ℃。

 

表1 引物序列

  

基因型引物序列GT1aF15’⁃GGCAGTGCAATGGATGAACCGG⁃3’R15’⁃ACGGATAGCAAGTTAGCCTTCAC⁃3’F25’⁃CTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCG⁃3’R25’⁃GACGCCGCTGCCTTAACCTCCT⁃3’GT1bF15’⁃CAGTGGATGAACCGGCTGATAGC⁃3’R15’⁃GTCTTCCAGCAAGTCCTTCCACACGG⁃3’F25’⁃GCTTCGCGGGGTAACCACGTCTCC⁃3’R25’⁃TTCGCCTTCATCTCCTTGAGCACGTCC⁃3’

1.3 电泳和测序 取第二轮PCR产物5 μL，配置1%的琼脂糖凝胶跑电泳，100 V电压电泳30 min。电泳结果与DL2000的Marker比对，有目的条带的PCR产物送去上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 序列比对和分析 从基因库网站下载HCV 1a型和HCV 1b型标准序列株，编号分别为AF009606.1和AJ238799.1，用 DNAMAN软件进行序列比对。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差)表示，计数资料采用百分率(%)表示，率的比较。

2 结 果

本组134例患者，有119例样本成功扩增出HCV NS5A区，扩增效率为88.8%，在成功扩增的119例(基因1a型19例，基因1b型100例)样本中有53例(44.5%)患者检测出NS5A抑制剂相关的耐药位点突变，基因1a型有7例(36.9%)，基因1b型有46例(46.0%)，其中基因1a型突变频率最高的位点是H58P+E62D，有4例(21.0%)，基因1b型突变频率最高的位点是R30Q，有23例(23.0%)。各基因型具体耐药位点突变及突变率，见表2。

由图8可知，酵母菌在模拟酒中的产气量随SO2质量浓度升高而降低，其中有氧环境活化所得酵母对SO2的耐受性显著高于厌氧环境活化所得酵母，但后者与普通方式活化所得酵母相比差异不显著。此外，有氧条件时，随活化培养液中碳源含量和氮源含量的增加，活化酵母菌对SO2的耐受性也随之提高，部分处理组差异显著。

在使用调查报告中的数据时,我们对原有内容进行了筛选和整合,但这些工作并不影响数据的真实性和有效性。实证部分的数据均来自该调查报告。

表2 基因1a型和1b型的具体位点突变及突变率[n(%)]

  

NS5A区相关位点突变GT1a(n=19)GT1b(n=100)Q30H1(5 3)-R30Q23(23 0)Q54H-5(5 0)H58P1(5 3)-P58S4(4 0)Y93H-6(6 0)M28T+H58P1(5 3)-H58P+E62D4(21 0)-L31M+R30Q-2(2 0)Q54H+R30Q-2(2 0)Q54H+P58S-4(4 0)

3 讨 论

由于HCV RNA依赖的RNA聚合酶低保真、缺乏校读活性，以及HCV自身高复制活性，病毒突变体在感染过程中不断产生RAVs，而这些RAVs可以影响DAAs药物抗病毒的疗效。已经上市的NS5A抑制剂主要有Daclatasvir、Ledipasvir、Ombitasvir、Elbasvir、Velpatasvir等，NS5A抑制剂现已被广泛应用于临床，然而有部分丙肝患者体内存在针对NS5A抑制剂的天然耐药位点突变，会影响抗病毒治疗的疗效[12]。

本研究发现基因1a型NS5A区相关位点突变率为36.9%，这与巴西Gaspareto等[13]报道的基因1a型26.0%的突变率相似，但高于意大利Caudai等[14]报道的4.9%突变率，低于Sun等[15]报道的100.0% 的突变率；本研究中基因1b型NS5A区相关位点的突变率为46.0%，均高于Sun等[15]及Caudai等[14]报道的22.4%和张玉等[16]报道的20.6%的突变率，低于Gaspareto等[13]报道的62.0%的突变率。这些研究结果的不一致，推测可能是HCV基因型的分布存在明显的地域性差异，其中基因1b型主要流行于日本、中国、南欧和东欧；基因1a型多见于西欧和北美国家，广西地区基因型分布以基因1b型为主，其次为3b和6a型。另外，也可能是与我们的研究病例数不够多有关，需进一步扩大样本研究。

本研究中基因1a型出现M28T、Q30H和H58P突变以及基因1b型出现R30Q、Q54H和P58S突变针对NS5A抑制剂耐药也是相对常见的，其中M28T、H58P和P58S主要是针对Daclatasvir耐药，Q30H主要对Daclatasvir、Ledipasvir和Ombitasvir产生耐药，R30Q主要针对Daclatasvir、Ledipavir 和Samatasvir等产生耐药，而Q54H主要是出现对Daclatasvir和ABT-267的耐药[18]。本研究基因1a型Q30H、H58P突变率均为5.3%，与Gaspareto等[13]、Caudai等[14]报道的研究结果相似；不同在于H58P+E62D联合突变达21.0%；基因1b型除了出现最常见的L31M和Y93H位点突变之外，还发现R30Q位点的突变率达23.0%，高于Caudai等[14]报道的2.0%的突变率，研究结果的不一致可能与地区差异有关。

上述研究主要关注引水调控对小型富营养化湖泊生态和环境的改善作用，近些年来，随着太湖、巢湖以及滇池等大型富营养化湖泊蓝藻水华暴发所引发的饮用水与生态危机日益严重，针对大型富营养化湖泊的引水调控工程受到有关部门的重视[5，25，40-45]，已成为缓解蓝藻水华灾害的重要水利工程措施。而不同于小型湖泊，大型富营养化湖泊的引水调控工程对湖泊生态与环境的改善效果受到多方面因素的影响和制约，短期内难以获得理想的结果，引水调控工程往往需常态化运行。因此，引水工程对大型富营养化湖泊水文水动力、物理化学环境以及生物的影响需进行长期的跟踪研究。

针对NS5A抑制剂耐药的相关位点突变最常见的是L31M和Y93H的突变，其中L31M主要是对Ledipasvir 耐药，对Daclatasvir可能耐药，而Y93H对Daclatasvir、Ledipasvir和Ombitasvir均产生明显耐药[8]。本研究中基因1a型未检测到这两个位点的突变，基因1b型患者有6.0%出现了Y93H突变，与张玉等[16]报道的7.61%和Caudai等[14]报道的6.6%的结果相似，但低于Sun等[15]报道的15.5%的结果。基因1b型患者出现L31M突变位点，与国内外[13-14,16]的研究结果相似，但不同的是本研究出现的L31M突变同时伴有R30Q的突变，而其他研究[17]中发现L31M主要是与Y93H联合突变。

本研究基因1a型及基因1b型患者除出现单一位点突变外，还发现联合位点突变情况，基因1a型的M28T+ H58P及H58P+E62D突变，基因1b型的L31M+ R30Q、Q54H+ R30Q和Q54H+ P58S突变，这些位点的联合突变是否会增加对抗病毒药物疗效的影响有待我们进一步研究。

综上所述，广西地区未进行过抗病毒治疗的基因1型丙型肝炎患者中有一定比例的患者存在针对NS5A抑制剂天然耐药位点突变，且突变有单位点突变也有联合位点突变。

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